[发明专利]一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法

摘要

本发明公开了一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，步骤包括1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片；3)各种纯包埋剂的配制；4)EP管隔离圈的制备；5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备；6)脱蜡和水化；7)放置EP管隔离圈；8)固定和漂洗；9)脱水和浸透；10)顶扣包埋；11)聚合；12)剥离；13)修块、切片、染色及电镜观测采图。本发明的有益效果本发明在节约试剂、减少试剂挥发所致误差的同时，使得最后得到的样品能完整剥离载玻片，方便了对石蜡包埋切片组织超微结构的进一步观察和研究。

主权项

一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：依次由下述步骤组成，1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的组织，利用倒置显微镜对待取样检测的组织进行初步定位；3)各种纯包埋剂的配制：(1)618包埋剂的配制：按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP‑30逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2‑十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP‑30为2‑4‑6‑三‑(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；(2)SPI－PonTM 812包埋剂的配制：将按重量份数分别将10份SPI–Pon 812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP–30逐样加入量杯中,充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2‑十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP‑30为2‑4‑6‑三‑(二甲胺基甲基)苯酚；SPI－PonTM 812包埋剂以下简称第二包埋剂；(3)Spurr(4221)包埋剂的配制：按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；4)EP管隔离圈的制备：将EP管剪除管盖，截取管口及其下方长度为1～2mm的完整一圈管作为隔离圈备用；所述EP管为锥形eppendorf离心管；5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备：(1)顶扣包埋用EP管的制备：将上步骤制备EP管隔离圈余下的EP管继续往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔离圈，并将EP管底部尖端截除，最后剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管；(2)预制包埋块的制备：将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合以得到包埋块，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；6)脱蜡和水化：将步骤2的载玻片放置于50mL离心管或50mL玻璃立缸，加入100％的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭 离心管或玻璃立缸后放于烘箱中60℃进行脱蜡3次，每次5～20min，再依次用体积浓度为100％、95％、90％、80％、70％和50％的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理1～10s，最后用双蒸水处理1～10s；7)放置EP管隔离圈：将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上；8)固定和漂洗：于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行前固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行后固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，得到固定和漂洗后的样品；所述前固定液是质量浓度为3％的戊二醛、所述后固定液是质量浓度为1％的锇酸、所述PBS缓冲液是0.1mol/L pH7.4的磷酸钠缓冲液；9)脱水和浸透：对上步骤固定和漂洗后的样品依次用4℃体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇溶液进行处理，每次5～20min，接着用4℃体积比为1∶1的90％乙醇溶液和90％的丙酮溶液混合液对样品进行处理5～20min，然后用4℃体积浓度为90％的丙酮溶液处理5～20min，再用100％丙酮溶液处理3次，每次5～10min，再分别用100％丙酮和纯包埋剂体积比为2∶1、1∶1、1∶2的混合液对样品进行梯度浸透，依次于37℃处理样品30min，吸除丙酮和包埋剂的混合液后，用纯包埋剂于37℃处理样品12h；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；10)顶扣包埋：(1)顶扣包埋用EP管顶扣包埋：将上步骤脱水和浸透后的样品上的包埋 剂吸净，将步骤5)所述的顶扣包埋用EP管倒置套入步骤4)所述的EP管隔离圈内，滴加步骤9)所用的纯包埋剂至倒置的顶扣包埋用EP管内；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；(2)预制包埋块顶扣包埋：滴加一滴步骤9)所用的纯包埋剂至载玻片上EP管隔离圈内的待取样区域，将提前聚合好的预制包埋块套入EP管隔离圈内，轻轻按压贴合；所述纯包埋剂为第一包埋剂、第二包埋剂、第三包埋剂中的一种；11)聚合：将上步骤完成顶扣包埋的样品放入烘箱中加热使包埋剂聚合，其中纯包埋剂为第一包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第二包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；纯包埋剂为第三包埋剂的样品聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；12)剥离：将上步骤完成聚合的样品取出，掰下包埋块，所得包埋块即为石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块；13)修块、切片、染色及电镜观测采图：将上步骤剥离下的石蜡包埋切片组织的透射电镜包埋块用修块仪和刀片修整，保留从载玻片剥离下的组织区域，在超薄切片机中定位、切片，获得待检测区域70～90nm厚的超薄切片，切片经过质量浓度为1～2％的醋酸双氧铀溶液及质量浓度为1～2％的柠檬酸铅溶液分别染色15～30min、5～10min后，在H‑7650透射电镜中进行观测采图，所得图片即为石蜡包埋切片组织的透射电镜图片。