[发明专利]鱼类类立克次氏体特异性PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及养殖领域，具体公开了鱼类类立克次氏体特异性PCR检测试剂盒及检测方法，本发明所述的鱼类类立克次氏体的PCR快速检测试剂盒，包括2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明克服了现有鱼类类立克次氏体检测方法的不足，提供一种新型PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明对鱼类类立克次氏体进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鱼类类立克次氏体提供了便利条件。

主权项

一种鱼类类立克次氏体的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)2×反应混合缓冲液，包含以下成分：KCl，MgCl2，Tris‑HCl，pH5.8，dNTP；(2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鱼类类立克次氏体的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物RLO‑F：5’‑TAGGAGATGAGCCCGCGTTG‑3’，下游引物RLO‑R：5’‑ATTTCACATCCAACTTAATCT‑3’；(3)Taq DNA聚合酶；(4)灭菌的ddH2O；(5)阳性对照液：鱼类类立克次氏体基因组DNA；(6)阴性对照液：ddH2O；采用试剂盒检测鱼类类立克次氏体的方法为：(1)鱼类类立克次氏体DNA的提取：取肝脏、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于‑20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入Tris‑饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用灭菌的ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于‑70℃保存备用；(2)PCR反应体系：采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液，上游引物、下游引物，5U/μL Taq DNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；(4)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；(5)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取产物在1.5％琼脂糖凝胶上，1.5％琼脂糖凝胶中含溴化乙锭，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；(6)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在390bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为类立克次氏体阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的类立克次氏体。