[发明专利]一株高产5-KGA的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一株高产5‑KGA的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用，（1）将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒，分别得自杀敲除质粒p△GOX1231和p△GOX1081；（2）将p△GOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU1；同样方法将p△GOX1081转入G.oxydans ZJU1中获取PDC基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU2；（3）将sldAB、pqqABCDE、tldD、P0169及细胞色素bo3氧化酶cyoBACD基因转入步骤（2）所得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌G.oxydans ZJU2中即得。GA2DH是氧化葡萄糖酸形成2‑KGA的主要酶，而PDC则与催化丙酮酸脱羧，形成乙醛相关，GA2DH和PDC的敲除可以解决5‑KGA形成过程中的代谢分流，减少副产物，实现5‑KGA的高产。

主权项

1.一株高产5‑KGA的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的自杀型敲除质粒p△GOX1231和PDC基因的自杀型敲除质粒p△GOX1081；所述重组整合型自杀质粒带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点；所述重组整合型自杀质粒pJKM的制备方法如下：（a）构建含SacB基因的克隆质粒pEASY‑Blunt‑SacB；（b）取测序正确的克隆质粒pEASY‑Blunt‑SacB，通过SspI单酶切克隆质粒pEASY‑Blunt‑SacB和自杀质粒pK18mobGII，回收并连接、转化进E. coli DH5α，筛选获取SacB连接方向正确的阳性克隆，并培养E. coli DH5α，提取整合型质粒，即得所述重组整合型自杀质粒pJKM；（2）将所得自杀型敲除质粒p△GOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为G. oxydans ZJU1；步骤（2）中所述宿主菌为野生型氧化葡萄糖酸杆菌G. oxydans DSM2343；（3）将所得自杀型敲除质粒p△GOX1081转入经传代后的G. oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G. oxydans ZJU2；（4）将sldAB、pqqABCDE、tldD、P0169及细胞色素bo3氧化酶cyoBACD基因转入步骤（3）所得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌G. oxydans ZJU2中即得。