[发明专利]一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用

摘要

本发明公开了一种与重组酶介导的体内基因叠加相兼容的体外基因叠加技术及其应用。本发明内容包括体外基因叠加系列载体的元件组成及体外基因叠加方法，该方法首先利用一个非可逆的位点特异性重组系统进行两个DNA分子间的共整合，然后利用一个可逆的位点特异性重组系统将不需要的DNA序列删除，最后利用第二个不可逆的位点特异性系统将体外叠加好的多基因载体转移到适合于农杆菌转化的双元载体中进行植物遗传转化，或者直接通过体内的位点特异性重组将多基因载体定点整合到基因组特定的座位上本发明既满足了体外基因叠加的需要，同时又可与体内重组酶介导的基因叠加系统相兼容。

主权项

1.一种体外基因叠加系统，其特征在于：该系统含有3个载体，即载体A、B、C；所述载体A中含有2个不同的不可逆重组位点A1和A2，A1与A2之间为外源目的基因插入区域；不可逆重组位点A1的另一端连有可逆的重组位点A’；所述载体B中含有3个不可逆重组位点B1、B2和B3，B2、B3之间为外源目的基因插入区域；B2的另一端连有B1，B1的另一端连有可逆的重组位点B’；所述载体C中含有3个不可逆重组位点C1、C2和C3，C2、C3之间为外源目的基因插入区域；C2的另一端连有C1，C1的另一端连有可逆的重组位点C’；所述A1、C2和C3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ‑1；所述B2和B3为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ‑2；所述A2、B1和C1为相同的不可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ‑3；所述SEQ‑1、SEQ‑2、SEQ‑3的序列均不相同；其中SEQ‑1与SEQ‑2之间能够发生不可逆的位点特异性重组；所述A’ 、B’和C’为相同的可逆重组位点，将其碱基序列记为SEQ‑4，两两之间均能发生可逆的位点特异性重组；当B3与A1位点发生不可逆的特异性重组时获得载体AB，即可实现载体A和载体B中的外源目的基因的叠加；同时，载体AB中的可逆重组位点A’和B’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将位点A’和B’之间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为AB‑；当载体AB‑中的B2与载体C中的C3位点发生不可逆的特异性重组时获得载体ABC，即可实现载体A、B、C中的外源目的基因的叠加；同时，载体ABC中的可逆重组位点和C’能够在对应的重组酶的作用下发生重组，将2个可逆重组位点间的碱基序列删除，只留下一个可逆重组位点，所得到的载体记为ABC‑；再将载体ABC‑与带有另一目的基因的载体B进行重组，当载体ABC‑的C2与载体B中的B3位点发生不可逆的特异性重组时，即可将这一目的基因再叠加进来；依次类推，若还需叠加其他目的基因，就交叉使用B、C载体携带目的基因，将携带目的基因B或C载体与重组后的载体再进行不可逆的位特异性重组，即可实现体外多基因的叠加。