[发明专利]一种肠道病毒71的检测方法及其试剂盒

摘要

本发明公布了一种肠道病毒71双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被有抗VP1多克隆抗体的酶标板；酶标抗VP1多克隆抗体；VP1抗原。本发明还公布了该试剂盒的制备方法及检测方法。本发明预先将抗VP1多克隆抗体和酶标抗VP1多克隆抗体制备试剂盒，制备方法简单，能够实现快速检测及标准化，采用抗VP1多克隆抗体对EV71各种基因型均有高结合效价，检测结果更加准确。

主权项

一种肠道病毒71双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：已包被有兔抗VP1多克隆抗体的酶标板；酶标鸡抗VP1多克隆抗体；VP1抗原；VP1抗原可以稀释成系列浓度建立标准曲线；还包括：洗涤液、稀释液、终止液、底物显示液、阳性对照血清和阴性对照血清的一种或多种；所述洗涤液是由吐温‑20与浓度为0.01mol/L、pH 为7.4 的磷酸盐缓冲液按照体积比1：1900～2200 混合配制而成；所述VP1抗原为灭活VP1蛋白；所述肠道病毒71双抗体夹心ELISA 试剂盒的制备方法包括以下步骤：(1)包被酶标板：采用包被液包被兔抗VP1多克隆抗体，4℃包被过夜，包被浓度为4.8～5.2μg/mL，100～120μL/孔，包被液为50mM碳酸盐缓冲液；(2) 封闭酶标板：甩去包被液，于吸水纸上扣干酶标板，每孔加入100～250μL封闭液，4℃封闭过夜，甩去封闭液，用洗涤液洗板3次，于吸水纸上扣干酶标板；(3) 酶标板包装：将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到包被有兔抗VP1抗体的酶标板 ；(4) 试剂盒制备：将酶标鸡抗VP1多克隆抗体IgY置于瓶中封口后和包装好的酶标板一起放置到包装盒中得到EV71双抗体夹心 ELISA 试剂盒；试剂盒检测方法包括以下步骤：1)分别加入待测样品、阳性对照血清和阴性对照血清，100～150μL/孔，37℃孵育50～150min ；2)甩去样品液，用洗涤液冲洗干净，加入1 ：2000 稀释的酶标鸡抗EV71多克隆抗体，100～120μL/孔，37℃孵育30min ；3)加入底物进行显色，100～200μL/孔，37℃反应15min；4)加入终止液终止反应；5) 用酶标仪测定OD值，根据Cut‑off 值判断阴性、阳性；所述多克隆抗体的制备包括以下步骤：1.1 免疫原的制备1.1.1 设计 EV71VP1 基因序列引物根据 GenBank登录号 ：EU024958.1查询到的 EV71 衣壳蛋白 VP1 基因序列，自行设计引物，引物序列为 ：上游引物的序列为5’‑TTCCATATGGGAGATAGGGTGGCDGATGTGATY GA‑3’ ；下游引物的序列为5’‑CCGCTCGAGGAGDGTGGTGATRGCRGTGCGACT‑3’；1.1.2 提取 EV71 病毒的 RNA提取由浙江 CDC 惠赠 的EV71 病毒的RNA为模板：使用美国 Roche 公司的病毒 RNA 抽提试剂盒，直接从培养的病毒中提取 RNA，操作步骤按试剂盒中的说明书进行，方法如下：1）取1.5mL离心管，做好标记后加入 409μL 已经混均的工作液；2) 用带滤芯无 RNase的吸头加入 200μL需抽提处理的样本，漩涡混合器上振荡混匀，短暂离心后，室温静置10min；3) 用带滤芯吸头加入 400μL 无水乙醇，漩涡混合器上振荡混匀，短暂离心；4) 将核酸抽提柱放置在2mL离心管上，取500μL步骤 3)的液体转移入核酸提取柱，12000rpm离心30s；5) 重复 4)，将步骤 3)中的剩余液体移入核酸提取柱，12000rpm 离心30s；6) 弃2mL离心管中的废液，在每个核酸抽提柱内加入500μL洗涤液 WA，12000rpm离心30s；7) 弃2mL离心管中的废液，在每个核酸抽提柱内加入 500μL 洗涤液WB，12000rpm离心30s；8) 弃2mL离心管中的废液，以最大转速离心2min；9) 弃2mL离心管，将核酸抽提柱置于一个无RNase的1.5mL离心管，在抽提柱的膜中央小心地加入30μL EB，静置1min，12000rpm 离心2min；10) 弃纯化柱，将离心回收的核酸暂时储存于4℃备用；1.1.3RT‑PCR扩增目的基因vp1通过RT‑PCR扩增目的基因vp1 ：1)RNA扩增的 RT‑PCR 体系如下：2)PCR扩增体系为25.0μL、5U/μL Taq 酶 1.0μL、RT酶1.0μL、10μM Primer‑F1.0μL、10μM Primer‑R1.0μL、模板RNA 4.0μL、RNase Free ddH2O 17.0μL;3)RT‑PCR扩增反应条件如下：RT‑PCR反应条件为Pattern 1 反转录反应42℃、15min、95℃ 2min；Pattern 2 PCR反应Cycle 45、95℃ 15sec；获得目的基因后，构建重组质粒，并转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，获得目的重组基因工程菌，获得重组工程菌后诱导表达目的蛋白，并收集包涵体；1.1.4 包涵体的复性与纯化①包涵体溶解 称取5g包涵体，重悬于100mL增溶缓冲液中，室温搅拌2h；13500rpm离心10min，弃沉淀，上清取样测蛋白浓度；所述增溶缓冲液为50mM Tris‑HCl，6M Gnd‑HCl，10mM DTT，1mM EDTA，pH8.5；②包涵体复性 在4℃环境中，上清中缓慢加入10L复性液，加完以后调整复性液pH到 8.0，调节温度到4℃，搅拌复性 48h；复性完成后，复性液10000rpm离心30min，收集上清液，保存备用；所述复性液为10mM PB，0.1M Arg，10％ Gly，1mM DTT，pH7.2；③包涵体纯化亲和层析柱采用平衡缓冲液进行平衡，平衡稳定后上样，上样完成后用平衡缓冲液中再次进行平衡5个柱体积，平衡缓冲液为20mM PB，0.5M NaCl，pH7.4，之后进行洗脱，洗脱缓冲液为20mM Tris，0.5M NaCl，0.5M 咪唑，pH8.0；洗脱时采用线性洗脱方式进行洗脱，即 Buffer B 经过 30min从 0上升至100％，大约10个柱体积；洗脱过程中收集单峰进行 SDS‑PAGE分析；获得高纯度抗原蛋白VP1；1.2 酶标鸡抗VP1多克隆抗体的制备1.2.1 动物免疫选取6‑8月龄刚开始产蛋的鸡种，采用重组蛋白VP1进行蛋鸡免疫，免疫程序如下：1) 首次免疫：采用高纯度抗原蛋白VP1与弗氏完全佐剂按体积比1:1 进行混合，充分乳化，进行翅下皮下注射，免疫量100μg/ 只；2) 二次免疫：间隔15天后进行第二次免疫，采用高纯度抗原蛋白VP1与弗氏不完全佐剂按体积比 1:1 混合，充分乳化，进行翅下皮下注射，免疫量50μg/只；3) 采血：第二次免疫之后7天进行采血，采用ELISA间接法检测抗体效价并收集鸡蛋；4) 加强免疫：第二次免疫之后间隔15天采用不完全佐剂与抗原进行加强免疫，继续收集鸡蛋直到抗体效价开始下降；1.2.2 多克隆抗体的提取与纯化采用水稀释法进行卵黄的粗提，提取液进行超滤浓缩之后，进行饱和硫酸铵沉淀，离心收集沉淀，PBS缓冲液复溶，再采用亲和层析进行纯化，最后将纯化后的鸡抗VP1多克隆抗体IgY冷冻干燥成冻干粉，置于‑80℃保存，备用；1.2.3 酶标抗体的制备经纯化的鸡抗VP1多克隆抗体，采用经典过碘酸钠法进行辣根过氧化酶标记，之后加等量无菌甘油置于‑80℃保存；1.3 兔抗 VP1 多克隆抗体的制备与纯化1) 首次免疫：用VP1 抗原免疫兔子，背部多点皮下注射，免疫量200μg/只；2) 二次免疫：间隔21天进行二免，100μg/只 ；3) 加强免疫：间隔21天进行加强免疫，100μg/只；4) 收集血清：第3次加强免疫后1周，心脏取血，收集血清 ； 5) 纯化并保存：采用Protein A柱进行亲和层析，收集高纯度抗 VP1多克隆血清体，‑20℃保存。