[发明专利]一种提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法

摘要

本发明涉及细胞工程组织培养技术领域，旨在提供一种显著提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法。该种显著提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养基配置、外植体消毒、外植体接种及愈伤组织诱导、胚性愈伤组织的诱导。本发明以黄菖蒲幼嫩胚为外植体，具有污染率低、材料易得的特点，其突出优势在于愈伤诱导效率高、外植体幼嫩少病毒、操作简便、获得的愈伤胚性好。

主权项

1.一种提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法，包括培养基的配置，其特征在于，所述提高黄菖蒲愈伤组织诱导率的方法具体包括下述步骤：(1)材料采取：在黄菖蒲花期后40～60天，取发育良好的蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏3～5天后，进行后续操作；(2)愈伤诱导培养基配置：配置愈伤诱导培养基的培养基溶液，然后将配置好的培养基溶液在121℃高压下灭菌15～20min后，在超净工作台上分装于经高压灭菌过的玻璃培养皿中，待培养基凝固后，用保鲜膜或锡纸包好，放在无菌环境中存放待用；所述愈伤诱导培养基采用添加30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.5～1.0mg/L6-BA和1.0～2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，或者添加30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.1～0.2mg/L KT、和1.0～2.0mg/L 2,4-D的MS培养基；培养基溶液的pH值为5.8～5.9；(3)外植体消毒：将步骤(1)中冷藏过的蒴果，在添加洗洁精和TWEEN-20的自来水中浸泡15～20min，再在流水下冲洗0.5～1h，然后在超净工作台上进行消毒处理：先将蒴果浸入体积浓度为70％酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发；(4)外植体接种及愈伤组织诱导：将步骤(3)处理后的蒴果，放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上；操作人员带上一次性PE手套后，沿种子纵轴方向轻轻撕开，即可看到白色的嫩胚，然后将种子暂放于经高压灭菌的空培养皿中，用镊子慢慢将胚取出接种至步骤(2)中制备的愈伤诱导培养基表面；再将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养7～10天，出现愈伤组织团块；(5)胚性愈伤组织的诱导：外植体在愈伤诱导培养基上培养20天后，部分幼胚顶端膨大并长出金黄色的愈伤组织团块，部分幼胚顶端愈伤组织为褐色水渍状并逐渐萎蔫；用解剖刀将幼胚顶端金黄色的愈伤组织团块切下，转接到最佳的愈伤诱导培养基上，在25摄氏度、黑暗条件下继续培养，用于后期研究；所述最佳的愈伤诱导培养基具体是指添加30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基。