[发明专利]一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法，以克隆轮状病毒VP6基因并体外转录形成RNA为标准品，在此基础上建立的TaqMan探针荧光定量PCR的检测方法；属于分子生物学领域；该方法包括以轮状病毒VP6基因为靶基因，设计引物和探针，设计实验找到最优条件下的退火温度、引物浓度、探针浓度；在引物外围再设计一对引物，并扩增片段，用该片段构建重组质粒，以构建好的重组质粒体外线性化后作为模板，转录获得RNA，十倍梯度稀释后做为标准品，进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线，并验证该方法的重复性，稳定性和灵敏性；用建立的Taqman荧光定量PCR，并对临床样品进行检测，该方法具有稳定性强、特异性好、假阳性低灵敏度高等特点。

主权项

一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）将轮状病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下外围引物扩增基因片段：上游引物：5’‑AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC‑3’，下游引物：5’‑AGGGAATTCTAATGGAAGCTACCGTGAAA‑3’；（2）将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体体外转录酶进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值 ，通过OD值计算RNA拷贝数；（3）将已知拷贝数的RNA做十倍梯度稀释，配制拷贝数为10³‑10⁹copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；（4）收集临床轮状病毒粪便样本，并提取样本的RNA；（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中轮状病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：上游引物：5’‑TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA‑3’，下游引物：5’‑TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG‑3’，探针：5’‑（FAM）TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC (TAMRA)‑3’。