[发明专利]CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法

摘要

本发明公开了CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法。具体而言，本发明提供能在酵母中组成型表达Cas9的核酸构建物，该核酸构建物含有与cas9基因操作性连接的酵母Tef1启动子，来自pBR322的复制起始位点及其筛选标记和来源于CEN6ARS4的复制区及其筛选标记，所述核酸构建物在酵母中为单拷贝复制，在大肠杆菌中为高拷贝复制。本发明还提供能在酵母中组成型表达sgRNA的核酸构建物、作为受体载体使用的核酸构建物以及DNA拼接方法。利用本发明可将两个以上待拼接大DNA片段直接在酵母菌中一次成功拼接为大质粒，省去了低效率的大片段DNA的体外酶切回收及遗传转化等操作，比传统方法更方便高效。

主权项

选自以下的核酸构建物：(1)能在酵母中组成型表达Cas9的核酸构建物，其中，所述核酸构建物含有与cas9基因操作性连接的酵母Tef1启动子，来自pBR322的复制起始位点及其筛选标记，来源于CEN6ARS4的复制区及其筛选标记，且所述核酸构建物在酵母中为单拷贝复制，在大肠杆菌中为高拷贝复制；(2)能在酵母中组成型表达sgRNA的核酸构建物，所述核酸构建物含有来源于2μ的载体复制区及其筛选标记、来自pBR322的复制起始位点及其筛选标记和sgRNA，所述sgRNA含有操作性连接的酵母启动子SNR52、20bp识别位点和Handle Cas9序列；和(3)作为受体载体使用的核酸构建物，所述核酸构建物含有来源于CEN6ARS4的载体复制区及其筛选标记，在酵母中为单拷贝复制；同时含弧菌二号染色体复制区oriCII及分配调控相关基因rctA、rctB、inc、parA、parB和筛选标记，在大肠杆菌中为单拷贝复制。