[发明专利]一种基于等重二甲基化标记的多重蛋白质定量方法

摘要

本发明涉及一种蛋白质组多重定量方法。它是利用酸性条件下二甲基化反应在肽段N末端氨基和肽段C末端赖氨酸侧链氨基上速率不同的性质，在酸、碱条件下先后实现肽段N末端和C末端的二甲基化标记。通过二甲基化标记试剂各种同位素形式有机组合实现肽段样品的多重标记。多重标记后的肽段一级谱质荷比完全相同，二级谱碎片离子的质荷比存在差异，提取相应二级谱碎片离子强度进行多重定量分析。该方法的优势在于：定量准确度高，精密度好，动态范围宽，可以同时实现六重蛋白质样品的同时定量分析，大大提高蛋白质定量分析的通量，节约分析时间。

主权项

1.一种基于等重二甲基化标记的多重蛋白质定量方法，其特征在于：利用作用位点为赖氨酸羧基的蛋白酶将蛋白质酶切成肽段，根据肽段的N末端氨基和C末端赖氨酸侧链氨基在pH酸性条件下反应速度不同的性质，依次在酸性、碱性条件下对肽段N末端和C末端进行二甲基化标记；通过二甲基化标记试剂甲醛CH2O、氰基硼氢化钠NaBH3CN及其相应同位素13CH2O、CD2O、13CD2O、NaBD3CN的组合实现两重至六重中一种或二种以上的标记，使肽段每端的标记有所不同，而肽段的总质荷比相同，从而使肽段在液质联用的质谱仪中得到的一级谱具有相同的质荷比，而二级谱每种碎片离子都存在质荷比差异，利用二级谱碎片离子强度进行蛋白质的多重定量分析；所述依次在酸性、碱性条件下对肽段N末端和C末端进行二甲基化标记，并通过二甲基化标记试剂甲醛、氰基硼氢化钠及其相应同位素的组合实现六重标记，六重标记试剂为：肽段N末端：13CH2O+NaBH3CN——肽段C末端：CD2O+NaBD3CN；肽段N末端：CD2O+NaBH3CN——肽段C末端：13CH2O+NaBD3CN；肽段N末端：13CD2O+NaBH3CN——肽段C末端：CH2O+NaBD3CN；肽段N末端：CH2O+NaBD3CN——肽段C末端：13CD2O+NaBH3CN；肽段N末端：13CH2O+NaBD3CN——肽段C末端：CD2O+NaBH3CN；肽段N末端：CD2O+NaBD3CN——肽段C末端：13CH2O+NaBH3CN；六重标记在每张二级谱上都同时出现，故提取每种标记肽段在二级谱上六重标记都同时出现的a、b、y碎片离子强度并加和，作为该种标记肽段的强度；将每重强度相比作为相对定量结果，进而实现六重定量分析；蛋白质样品经过变性还原烷基化后，加入作用位点为赖氨酸羧基的蛋白酶，孵育；将一份酶解后的蛋白样品首先在酸性条件下选择性二甲基化标记肽段末端的氨基；然后在碱性条件下相应的二甲基化标记肽段赖氨酸上的氨基。