[发明专利]一种遗传性耳聋基因检测试剂盒

摘要

一种遗传性耳聋基因分型检测试剂盒，包括PCR反应液A，检测遗传性耳聋基因235delC、299—300delAT、176del16及内参HBB，PCR反应液B，检测遗传性耳聋基因35delG、IVS7‑2A>G、2186A>G及内参HBB，PCR反应液C，检测遗传性耳聋基因A1555G、C1494、538C>T及内参HBB，Taq/UNG酶混合液，阳性对照，阴性对照。本发明利用不同荧光标记的探针，采用同一样本进行4管PCR扩增的方法，能同时检测235delC、299—300delAT、176del16、35delG、IVS72A>G、2186A>G、A1555G、C1494、538C>T和人β‑globin，并确定其型别，与现有检测试剂盒相比，具有以下优势：具有更高的特异性和灵敏度；封闭检测，无需PCR后反应，避免交叉污染和环境污染；可实现一管PCR反应检测多种型别，更简便和快速；分三管扩增能检测9种遗传耳聋突变基因，检测型别多，使用方便。

主权项

1.一种遗传性耳聋基因分型检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液A，检测遗传性耳聋基因235delC、299—300delAT、176del16及内参HBB，PCR反应液B，检测遗传性耳聋基因35delG、IVS7‑2A>G、2186A>G及内参HBB，PCR反应液C，检测遗传性耳聋基因A1555G、C1494、538C>T及内参HBB，Taq/UNG酶混合液，阳性对照，阴性对照；所述的PCR反应液A包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1‑200μM的235delC的引物和探针、1‑200μM的299—300delAT的引物和探针、1‑200μM的176del16的引物和探针、1‑200μM的HBB的引物和探针及无菌蒸馏水；所述的PCR反应液B包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1‑200μM的35delG的引物和探针、1‑200μM的IVS7‑2A>G的引物和探针、1‑200μM的2186A>G的引物和探针、1‑200μM的HBB的引物和探针及无菌蒸馏水；所述的Taq/UNG酶混合液包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述的阴性对照为含有粘蛋白和BSA的TE缓冲液；所述的阳性对照为包括遗传性耳聋基因235delC、299—300delAT、176del16、35delG、IVS72A>G、2186A>G、A1555G、C1494、538C>T和人β‑globin的线性化重组质粒的混合液、粘蛋白和BSA的TE缓冲液；所述的PCR反应液C包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1‑200μM的A1555G的引物和探针、1‑200μM的C1494的引物和探针、1‑200μM的538C>T的引物和探针、1‑200μM的HBB的引物和探针及无菌蒸馏水；具体的10×PCR buffer为1‑200mM KCl、1‑200mM(NH4)2SO4、1‑200mM Tris‑HCl；MgCl2为1‑25mM MgCl2；dNTPs为1‑25mM dATP、1‑25mM dGTP、1‑25mM dCTP、1‑12.5mM dUTP、1‑12.5mM dTTP混合物；其中，上述各引物探针特异性设计如下：(1)235delC引物探针为：上游引物F1；5’‑CCAGCATTGGAAAGATCTGGC‑3’下游引物R1：5’‑GCCACTAGGAGCGTGGCGTGGACAC‑3’探针P1：5’‑FAM‑GGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTC‑BHQ‑3’(2)299—300delAT引物探针为：上游引物F2；5’‑CCAGCATTGGAAAGATCTGGC‑3’下游引物R2：5’‑GCCACTAGGAGCGTGGCGTGGACAC‑3’探针P2：5’‑HEX‑GAACGTGTGCTACGATCACTACTTC‑BHQ‑3’(3)176del16引物探针为：上游引物F3；5’‑GCACGCTGCAGACGATCCTG‑3’下游引物R3：5’‑GCAGGGTGTTGCAGAACAAAGTCG‑3’探针P3：5’‑ROX‑GGAAAGATCTGGCTCACCGTCTT‑BHQ‑3’(4)内参HBB引物探针为：上游引物F4；5’‑TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT‑3’下游引物R4：5’‑TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA‑3’探针P4：5’‑CY5‑ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC‑BHQ‑3’(5)35delG引物探针为：上游引物F5；5’‑ATGGATTGGGGCACGCTG‑3’下游引物R5：5’‑GACCTTCTGGGTTTTGAT‑3’探针P5：5’‑FAM‑ATCCTGGGGGTGTGAA‑BHQ‑3’(6)IVS72A>G引物探针为：上游引物F6；5’‑GTACGACGGCTTCTCCAT‑3’下游引物R6：5’‑GACAGTCTTCTCCGTGGG‑3’探针P6：5’‑HEX‑TGGCCTACCGGAGACGAGAAG‑BHQ‑3’(7)2186A>G引物探针为：上游引物F7；5’‑TCCGCATCGAAGGCTCCCT‑3’下游引物R7：5’‑AAGATCTGGCTCACCGTCTT‑3’探针P7：5’‑ROX‑GTACGTCTTCTATGTCATGTACG‑BHQ‑3’(8)A1555G引物探针为：上游引物F8；5’‑CATCAAGGGGGAGATAAAGAG‑3’下游引物R8：5’‑ACGACGGCTTCTCCATGCAGC‑3’探针P8：5’‑FAM‑GGCTCCCTGTGGTGGACCTACACAG‑BHQ‑3’(9)C1494引物探针为：上游引物F9；5’‑GTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTG‑3’下游引物R9：5’‑GTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTG‑3’探针P9：5’‑HEX‑TGGCCTACCGGAGACGAGAAG‑BHQ‑3’(10)538C>T引物探针为：上游引物F10；5’‑CTCTTCCTCTACCTGCTGC‑3’下游引物R10：5’‑GCCCACCATGAAGTAGGTG‑3’。