[发明专利]一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法

摘要

本发明公开了一种一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法。快速准确的基因分型有助于HEV感染毒株的分子流行特征调查和污染源溯源，从而对污染源进行跟踪与监控。本发明采用的步骤如下1)设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值；所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；2)HRM一步法分型鉴定。本发明大大提高了监测效率，降低了使用成本。

主权项

一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定戊型肝炎病毒的方法，其对食品中的HEV毒种进行基因型鉴定，包括如下步骤：1)HRM引物的设计对比分析已发表的不同来源1、3、4型HEV全基因序列，针对其ORF3序列设计一对外侧引物和一对内侧引物，外侧引物Tm的值低于内侧引物的Tm值，所述的外侧引物为：GAA+TGA+ATAA+CAT+GT，tggtcacgccaag，所述的内侧引物为：CCGGCGGTGGTTTCTGG，GCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT；+T，+A，+C，+G为经LNA修饰的碱基；所述的两对引物在套式PCR反应中对样本中的不同基因型HEV毒株均能扩增；同时，不同种基因型的扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点，以获得不同的高分辨率溶解曲线峰型，满足HRM对于HEV基因型的鉴定分析；2)HRM分型鉴定在每个样品测试管中加入200x RT‑Enzyme solution 0.1μL，5x RT‑PCR Reaction Mix 4.0μL，20μM外侧引物各0.4μL，20μM内侧引物各0.8μL，10×饱和染料LC green 2μL，去离子水3.5μL，最后加入样本RNA 8μL，500 r/min离心30s，置于荧光定量PCR仪中进行一步法高分辨率溶解曲线分型鉴定。