[发明专利]一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法

摘要

本发明涉及天然产物生物化学技术领域，具体公开一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法。该方法采用辣木非胚性细胞生产辣木多糖，获得的非胚性细胞，类型单一，细胞充分分散，增值效率极高，生长周期一致，产量易于调控；对辣木外植体进行诱导增殖培养获得悬浮细胞后，进一步的模拟辣木高温、高光照的自然生长环境，并优选液体复合高糖增殖培养基，选择高浓度的红糖代替蔗糖，培养过程中刺激辣木细胞合成辣木多糖，提高多糖产量。本发明方法可工厂化生产辣木多糖，不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源，和种植辣木相比(生产周期3～5年)，本发明方法生产周期缩短至7～10天，生产规模便于控制，投资风险小。

主权项

一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：（1）取辣木外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；（2）将步骤（1）中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；（3）将步骤（2）获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；（4）将步骤（3）获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的非胚性悬浮细胞系；（5）将步骤（4）获得的非胚性悬浮细胞系在液体复合高糖增殖培养基中悬浮培养3~7 天，离心沉淀，获得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；（6）取步骤（5）获得的非胚性悬浮细胞，水提取1~3 次，合并提取液，在提取液中加入无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量60~75%，取上清液，旋蒸至恒重，获得辣木粗多糖；其中步骤（5）中所述的液体复合高糖增殖培养基的配方为：MS 培养基 + 红糖35~55 g/L +2，4‑D 0.5~2 mg/L，pH 5.5~6.0，培养温度为30~35℃，光照强度4000~6000 Lux，每日光照时长为8~12 小时，120~150 rpm 回旋式震荡培养，培养时间为3~7 天；步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基 + 红糖20~40 g/L +2，4‑D 1~3 mg/L+ NAA 0.1~1 mg/L+质量分数0.8~1.2%琼脂，pH 为 5.5~6.0，培养温度为24~28℃，光照强度2000~4000Lux，每日光照时长为8~12 小时，培养时间为25~35 天；步骤（2）中所述的愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基 + 红糖20~40 g/L +2，4‑D 3~4 mg/L +质量分数0.8 %琼脂，pH 为5.5~6.0，培养温度为25~28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28~35 天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125~0.25 cm3；步骤（3）中所述的细胞悬浮启动培养基的配方为：MS 培养基 + 红糖18~22 g/L +2，4‑D 0.25~1 mg/L，pH 为5.5~6.0；培养温度为24~27℃，培养方式为暗培养，120~150rpm 回旋式震荡培养，培养周期为10 天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10~1/20；步骤（4）中所述的液体增殖培养基的配方为：MS培养基 + 红糖25~35 g/L +2，4‑D 0.5~2 mg/L，pH 5.5~6.0，培养温度为24~27℃，暗培养，120~150 rpm 回旋式震荡培养，培养7~10 天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10 天，继代周期为7~10 天，继代时接种量为液体增殖培养基体积的1/6~1/10；步骤（1）中所述的辣木外植体为未成熟的辣木种子。