[发明专利]一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，属分子标记技术领域。该方法将待鉴定样品PCR反应获得扩增产物测序后，与碧螺春母树品种条形码比对，当扩增产物的SNP序列与碧螺春适制品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。本发明克服了用感官审评或理化分析等方法难以鉴别碧螺春茶的真伪以及山茶属下不同茶树品种的技术问题，能有效、简便快速地对碧螺春商品茶的品种进行准确鉴定。 1

主权项

1.一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1）确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个基因序列；所述6个SNP位点的基因序列参见SEQ ID NO:1~6，所述在NCBI中通过blast找到的对应的基因，其基因序列参见SEQ ID NO:7~12；2）引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物，并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物；所述引物序列参见序列表SEQ ID NO:13~24；3）基因组DNA提取：4）PCR扩增及检测；5）将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱基序列如SEQ ID NO ：25~30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种；所述基因组DNA提取采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要操作步骤为：a）将0.1 g的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至白色粉末状，并转移至1.5 mL离心管，然后在离心管中加入0.6 mL预热的CTAB提取液并充分震荡混匀，65℃水浴一小时，期间不断震荡混匀；b）在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5 min；c）使用离心机在4℃下10000 rpm离心10 min，吸上清液至新离心管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5 min；d）使用离心机在4℃下10000 rpm离心10 min，吸上清液至新离心管，加入等体积的异丙醇混匀后在‑20℃下放置1 h以上；e）使用离心机在4℃下5000 rpm离心5 min，弃上清液收集沉淀；f）在离心管中加入高盐缓冲液，在65℃水浴，溶解沉淀；g）使用离心机在4℃下10000 rpm离心5 min，吸上清液于新离心管；h）在管中加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，混匀，在‑20℃放20 min；i）使用离心机在4℃下5000 rpm离心5 min，弃上清液，收集沉淀；j）使用70%的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀；k）使用300 μL超纯水溶解沉淀，加入0.5RNase使RNA降解；l）使用NanoDrop ND‑1000分光光度计测定浓度和纯度；m）使用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。