[发明专利]一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法

摘要

一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法，属真菌物种鉴定领域。该方法使用RPB2基因作为捕食线虫丝孢菌节丛孢属鉴定的目标DNA条形码基因，采用合并节丛孢属样本实验数据和目标真菌数据的策略构建高容量数据库，同时使用待鉴别真菌的RPB2基因与基因库进行比较，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和聚类分析的系统发生树法设立鉴定的规则鉴别物种。有益效果在于：RPB2基因作为最适合鉴别捕食线虫丝孢菌的DNA条形码，具有通用、易扩增、易比对的特点；该鉴别方法的鉴定效率及其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的DNA条形码方法，弥补了捕食线虫丝孢菌DNA条形码分子标记的空白，为捕食线虫丝孢菌的种质资源挖掘、生防应用和遗传多样性研究提供有力的研究工具。

主权项

一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法，其特征在于该方法包括RPB2基因序列片段的基因库的建立和新样品的鉴别步骤；其中：(1)RPB2基因序列片段的基因库的建立：收集《中国真菌志》第三十三卷《节丛孢及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种为材料，然后提取其基因组DNA，以其为模板，优选SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56引物序列扩增样品的RPB2基因序列片段，由此建立包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库；所述基因库包括下述序列编号所示的RPB2基因序列片段：SEQ ID NO.1‑54；(2)新样品的鉴别：通过将待鉴别真菌的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对，基于Kimura‑2‑parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种，获得多个序列间的相似性，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别真菌的物种；具体如下：a.基于Kimura‑2‑parameter概率的遗传距离法设立鉴定规则来鉴别物种将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对，使用Mega6.0软件计算未鉴定样品DNA条形码序列与数据库中每一个序列的Kimura‑2‑parameter遗传距离，计算种内种间变异值，鉴别物种；对于基因库内的捕食线虫丝孢菌序列，已经计算出捕食线虫丝孢菌节丛孢属的种内最大变异值，当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种；b.基于聚类分析的系统发生树法设立鉴定规则来鉴别物种应用MEGA或PAUP软件构建NJ、ML、MP系统发育树，检验未鉴定样品的DNA条形码序列与数据库中序列聚类在一起的物种，若未知样品与数据库中的物种构成单支系，则鉴定为该物种。