[发明专利]一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，本发明公开了一种卵巢癌干细胞疫苗及其的制备方法和用途。肿瘤干细胞对放疗、化疗不敏感，是肿瘤转移、复发的根源。针对肿瘤干细胞的主动免疫治疗，消灭肿瘤的“种子”细胞即肿瘤干细胞，只有这样方能取得较理想的疗效。本发明中CD117+CD44+卵巢癌干细胞疫苗在动物实验中能够提高血清IFN-γ水平，下调TGF-β的表达，增强NK细胞活性，显著降低CD117+CD44+卵巢癌干细胞数量，抑制肿瘤的生长。

主权项

一种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，(1)获取准备卵巢癌细胞，进行传代培养，以10％胎牛血清的RPMI1640为培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，细胞长至一定密度，胰酶消化吹散后，继续传代培养；(2)取免疫磁珠分选MACS缓冲液悬浮卵巢癌细胞；每1×10⁷～1×10⁸卵巢癌细胞，加入100μl FcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；(3)每1×10⁷～1×10⁸细卵巢癌细胞，加入CD44+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育20min，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2‑4次；(4)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；(5)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入步骤(4)的细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞‑CD44‑卵巢癌细胞；(6)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞‑CD44+卵巢癌细胞；(7)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮分选步骤(6)得到的CD44+卵巢癌细胞，过夜培养48h；(8)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入100μl FcR阻断剂，混匀后4℃孵育30min；(9)每1×10⁷～1×10⁸细胞，加入CD117+磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4℃孵育一段时间，之后加PBS洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复PBS洗涤2‑4次；(10)取免疫磁珠分选MACS用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；(11)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞‑CD117‑卵巢癌细胞；(12)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞；(13)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞CD117+卵巢癌细胞，即为CD117+CD44+卵巢癌细胞；(14)培养至细胞状态稳定，48h内制备卵巢癌干细胞疫苗。