[发明专利]一种玉米抗粗缩病鉴定方法

摘要

本发明公开了一种玉米抗粗缩病鉴定方法，该方法步骤如下1）选择鉴定标尺；2）低氧诱导待测玉米和鉴定标尺的胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养；4）荧光定量PCR获得各玉米品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；5）绘制RBSDV增殖指数趋势线；6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平和抗性等级。本发明通过胚芽鞘内RBSDV增值趋势差异来评价玉米品种对粗缩病抗性水平，能够在短期内从分子水平上确定玉米品种抗粗缩病的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。

主权项

一种玉米抗粗缩病鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对玉米粗缩病表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应玉米品种作为鉴定标尺；2）低氧诱导待测玉米和鉴定标尺的胚芽鞘：每个品种取10‑16粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；4）荧光定量PCR获得各玉米品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）：按照周期时间点采集待测玉米和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40‑60g，每个品种每个取材时间点取材2‑3重复，‑70℃保存，提取RNA并纯化，取1μL上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物RBSDV‑F：5’‑AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG‑3’和RBSDV‑R：5’‑TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG‑3’按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；5）绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx；6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平和抗性等级：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测玉米品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品种。