[发明专利]一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法

摘要

本发明公开了一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法。完整梯烷脂是存在于厌氧氨氧化菌胞内厌氧氨氧化体膜上的一种特殊磷脂。已有研究表明以完整梯烷脂为研究对象，可为厌氧氨氧化的研究提供新思路及新的支撑信息，具有较高的生态和生理学研究意义。本方法的操作流程为取样→冷冻干燥→加入提取液→超声提取→调整提取液组分比例→离心分液→氮吹浓缩。经高效液相串联质谱分析，证明该方法效果良好，提取纯度高。

主权项

一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂超声提取方法，其特征在于，包括如下步骤： 1）取样 ：取 15ml 污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥 ；离心后去除上层水分 ；2）冷冻干燥：采用真空冷冻干燥技术去除步骤 1）的样品中间隙水分，即运用北京博医康公司冷冻干燥机对污泥样品进行处理，参数设置为 ：真空度 0.08 ～ 0.09Mpa、温度 ‑40℃； 冷冻干燥 24h，将冷冻干燥后的样品置于 ‑20℃的冰箱里备用 ；3）加入提取液 ：将步骤 2）得到的干燥样品 8g 置于 50ml 玻璃离心管中，并加入 10mL 甲醇、5mL 二氯甲烷和 4mL 磷酸盐缓冲液形成提取液，其中，甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为 2:1:0.8 ；4）超声提取 ：在步骤 3）中的玻璃离心管外设置冰浴，运用 SCIENTZ‑IID 超声细胞破碎机中进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启 4s，关闭 5s ； 其中，超声总时间为 15min； 超声波破碎仪的运行参数设置为：超声波频率 20KHz，超声能量 414W，变幅杆直径为 6mm，功率密度 1465W/cm2 ； 5）调整提取液组分比例 ：向步骤 4）的玻璃离心管中加入 5mL 二氯甲烷和5mL 磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为 1:1:0.9 ；6）离心分液 ：将步骤 5）的玻璃离心管在 5000rpm 下离心 10min ；将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体 ；为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤 3）‑6）重复操作 4 次，以增 加可收集的有机相液体 ；7）氮吹浓缩：将上述五次收集的下层的有机相液体收集于玻璃试管中，并置于 MD 200 氮吹仪中进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀 ；将底层沉淀溶解在 1mL 的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比 4 ：1 的正己烷和异丙醇 ；然后用孔径为 0.45μm 的有机滤膜 过滤得到完整梯烷脂母液，置于 ‑80℃的冰箱中存放。