[发明专利]小麦3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因TaHMGR及其分离克隆、定点突变及酶功能的检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦甲羟戊酸代谢途径中类异戊二烯物质合成的第一个关键酶基因的分离克隆、基因定点突变、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶活性检测技术，为进一步进行基因改造和修饰、构建3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

主权项

1.小麦3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因TaHMGR在基因定点突变、构建3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物上的应用，其特征在于：所述小麦3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因TaHMGR，其编码区核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No.2所示；所述小麦3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因密码子的定点突变的方法，具体步骤如下：1.1密码子突变引物的设计突变体的上下游引物分别为：I93VF:CGTGGGCGTCGCCGGGCCGC，其核苷酸序列如Seq ID No.16所示，I93VR:GCGGCCCGGCGACGCCCACG，其核苷酸序列如Seq ID No.17所示，密码子由ATC突变为GTC；1.2突变体的PCR扩增以构建的小麦3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因催化区野生型表达载体质粒为DNA模板，合适的退火温度，进行PCR扩增；1.3突变体PCR扩增产物的转化、测序用Dpn1限制性内切酶去除模板质粒DNA，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒DNA并测序确定突变位点；将阳性克隆转化到表达菌株中，进行蛋白质表达。