[发明专利]一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法

摘要

本发明涉及利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法，有效解决云芝免疫调节蛋白的制备问题，按照毕赤酵母密码子偏好性合成云芝免疫调节蛋白FIP-tvc基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1；用限制性内切酶酶切合成的云芝免疫调节蛋白FIP-tvc与表达质粒载体X，构建重组表达质粒X-FIP-tvc，用限制性内切酶对重组表达质粒载体X-FIP-tvc线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，用含抗生素的平板和PCR方法筛选出组成型阳性转化子或诱导型阳性转化子，选出诱导型高水平分泌表达rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株，发酵培养或诱导表达3-7d，发酵上清液用硫酸铵沉淀，沉淀透析24-48h，层析柱亲和交换层析，干燥，得云芝免疫调节蛋白FIP-tvc固体粉末，本发明成本低、周期短、技术上容易，适于工业化生产，纯度高。

主权项

一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）按照毕赤酵母密码子偏好性合成云芝免疫调节蛋白FIP‑tvc基因的核苷酸序列 SEQ ID NO.1；所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞GS115；（2）利用限制性内切酶酶切步骤（1）中合成的云芝免疫调节蛋白FIP‑tvc与表达质粒载体X，构建重组表达质粒X‑FIP‑tvc，方法是，将合成的基因序列FIP‑tvc与质粒载体X利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将FIP‑tvc的酶切片段与质粒载体X酶切片段连接，得到重组表达质粒X‑FIP‑tvc，转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增；所述的表达质粒载体X为组成型表达质粒载体pGAPZαA或诱导型表达质粒载体pPICZαA；（3）利用限制性内切酶对重组表达质粒载体X‑FIP‑tvc进行线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，应用含抗生素的平板和PCR方法筛选出组成型阳性转化子或诱导型阳性转化子；（4）表达重组蛋白rFIP‑tvc毕赤酵母菌株的发酵筛选：从步骤（3）发酵筛选出的组成型阳性转化子在YPD液体培养基中培养3‑5d后，发酵上清液以SDS‑PAGE检测蛋白质表达量，筛选出组成型分泌表达rFIP‑tvc的毕赤酵母重组菌株；或从步骤（3）筛选出的诱导型阳性转化子在BMSY培养基中培养2‑4d，菌液加入甲醇进行重组蛋白的诱导表达，诱导3‑7d，发酵上清液以SDS‑PAGE检测蛋白质表达量，筛选出诱导型高水平分泌表达rFIP‑tvc的毕赤酵母重组菌株；（5）毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化云芝免疫调节蛋白FIP‑tvc，将步骤（4）筛选出的rFIP‑tvc的毕赤酵母重组菌株进行发酵培养或诱导表达3‑7d，发酵上清液用硫酸铵进行沉淀，沉淀用平衡缓冲液进行溶解并用平衡缓冲液进行透析24‑48h，将透析后的蛋白样品上平衡缓冲液透析后的Ni‑NTA层析柱进行亲和交换层析，获得纯化的重组蛋白rFIP‑tvc，以真空冷冻干燥或喷雾干燥等方法制得云芝免疫调节蛋白FIP‑tvc固体粉末。