[发明专利]一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法

摘要

本发明涉及一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法，该融合蛋白为植物种子胚乳表达Ex4‑TF融合蛋白，其基因序列中包括：植物胚乳特异性表达启动子pGluB‑5，植物胚乳储藏蛋白信号肽sp，艾塞那肽多肽Exendin‑4，连接Exendin‑4和人铁转运蛋白hTF的连接多肽(GGGGS)x3linker，人铁转运蛋白hTF，用于蛋白质纯化的组蛋白标签6xHis，以及植物GluB‑5基因转录终止子GluB‑5‑3’‑UTR。本发明利用GluB‑5启动子可以实现融合蛋白在整个胚乳中大量表达。同时还可利用水稻具有产量高，容易种植及管理，以及水稻种子耐储存、好提取等优点，实现Ex4‑TF融合蛋白药物的持续性生产，而不会造成浪费及短缺的问题，同时降低生产成本。

主权项

1.一种融合蛋白的生产方法，其特征是包括如下步骤：/n1)以水稻密码子优化并合成水稻种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因，其基因序列中包括：水稻胚乳特异性表达启动子pGluB-5，水稻胚乳储藏蛋白信号肽sp，艾塞那肽多肽Exendin-4，连接Exendin-4和人铁转运蛋白hTF的连接多肽(GGGGS)x3 linker，人铁转运蛋白hTF，用于蛋白质纯化的组蛋白标签6xHis，以及水稻GluB-5基因转录终止子GluB-5-3’-UTR；所述Ex4-TF融合蛋白基因有两种，艾塞那肽分别位于融合蛋白的N端和C端，分别称为Ex4-TF融合蛋白A基因和Ex4-TF融合蛋白B基因，其中，Ex4-TF融合蛋白A基因的DNA序列为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；Ex4-TF融合蛋白B基因的DNA序列为SEQID NO.3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4；/n其中水稻胚乳特异性表达启动子及GluB-5基因转录终止子的克隆方法为：根据水稻基因组中水稻GluB-5基因的启动子及转录终止子序列，设计引物，从水稻日本晴基因组DNA中通过PCR扩增并克隆该序列；/n其中，水稻GluB-5启动子的5’引物如SEQ ID NO.13所示，水稻GluB-5启动子的3’引物如SEQ ID NO.14所示，水稻GluB-5基因转录终止子的5’引物如SEQ ID NO.15所示，水稻GluB-5转录终止子的3’引物如SEQ ID NO.16所示；/n2)构建该Ex4-TF融合蛋白胚乳特异性表达的水稻双元表达载体，其具体包括如下步骤：体外连接GluB-5基因的启动子，Ex4-TF融合蛋白基因及转录终止子，以质粒CAMBIA1301为骨架，将Ex4-TF融合蛋白基因表达框克隆T-DNA的左右边界之间，形成的载体包括Ex4-TF融合蛋白基因、用于转基因检测的GUS报告基因和用于使被转化的水稻细胞抗潮霉素的HptII基因；/n3)将所述Ex4-TF融合蛋白基因导入水稻愈伤组织细胞，并通过筛选获得遗传转化水稻植株。/n