[发明专利]藻体富里酸的XAD‑8树脂分级方法

摘要

本发明公开了藻体富里酸的XAD‑8树脂分级方法，所述方法包括如下步骤藻体预处理、藻体索氏提取、藻体的氯化钙处理、藻体的碳酸钠处理、藻体的碱液提取、藻体中富里酸的树脂吸附、富里酸亚组分分级淋洗、富里酸亚组分样品的纯化。通过上述方式，本发明能够从藻体中提取富里酸，并利用XAD‑8树脂分离技术进行亚组分分级分离，最终得到分级的藻体富里酸亚组分。

主权项

藻体富里酸的XAD‑8树脂分级方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a、藻体预处理：取风干后的藻体剔除杂物，在30‑50oC条件下烘干20‑28 h，碾磨过筛，得到藻体粉末；步骤b、藻体索氏提取：将藻体粉末置于索式提取器中，用乙醚为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醚索提藻体；将乙醚索提藻体置于索式提取器中，用丙酮为提取液进行索氏提取，所得固体标记为丙酮索提藻体；将丙酮索提藻体置于索式提取器中，用95%乙醇为提取液进行索氏提取，所得固体标记为乙醇索提藻体；将乙醇索提藻体置于索式提取器中，用二氧杂环己烷为提取液进行索氏提取，所得固体标记为二氧杂环己烷索提藻体；将二氧杂环己烷索提藻体置于索式提取器中，用去离子水为提取液进行索氏提取，所得固体标记为去离子水索提藻体；步骤c、藻体的氯化钙处理：向去离子水索提藻体中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50‑70oC条件下连续搅拌15 ‑30min，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体1；向氯化钙处理藻体1中加入氯化钙溶液，使固液比达到1：10，在50‑70oC条件下连续搅拌15‑30 min后，离心分离后弃去上层清液，得到氯化钙处理藻体2；向氯化钙处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10‑30 min后，离心分离后弃去上层清液，得到去离子水处理藻体；向去离子水处理藻体中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10‑30 min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体1；向盐酸处理藻体1中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10 ‑30min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体2；向盐酸处理藻体2中加入盐酸，使固液比达到1：10，连续搅拌10‑30 min后，离心分离后弃去上层清液，得到盐酸处理藻体3；向盐酸处理藻体3中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10 ‑30min后，离心分离后弃去上层清液，得到水洗盐酸处理藻体；步骤d、藻体的碳酸钠处理：向水洗盐酸处理藻体中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30‑45oC条件下连续搅拌30‑60 min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体1；向碳酸钠处理藻体1中加入碳酸钠溶液，使固液比达到1：10，在30‑45oC条件下连续搅拌30‑60 min后，离心所得固体标记为碳酸钠处理藻体2；向碳酸钠处理藻体2中加入去离子水，使固液比达到1：10，连续搅拌10‑30 min后，离心所得固体标记为水洗碳酸钠处理藻体；步骤e、藻体的碱液提取：氮气保护条件下，向水洗碳酸钠处理藻体中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1 mol/L且固液比为1:10，搅拌4‑6 h，静置20‑28h后，离心得到上层清液1和藻体残渣1；氮气保护条件下，向上层清液1中加入盐酸，使其pH =1.0‑3.0，搅拌30‑60 min，静置20‑28h后，离心得上层清液标记为富里酸1；氮气保护条件下，向藻体残渣1中加入氢氧化钠和焦磷酸钠，并用去离子水稀释，使氢氧化钠和焦磷酸钠浓度均为0.1 mol/L且固液比为1:10，搅拌4 ‑6h，静置20‑28 h后，离心得到上层清液2和藻体残渣2；氮气保护条件下，向上层清液2中加入盐酸，使其pH =1.0‑3.0，搅拌30‑60 min，静置20‑28h后，离心得上清液标记为富里酸2；将富里酸1和富里酸2合并，标记为粗提富里酸溶液；步骤f：藻体富里酸的树脂吸附：将粗提富里酸溶液以10‑15倍柱体积/h的流速通过XAD‑8树脂柱，弃去流出液；步骤g：富里酸亚组分分级淋洗：用pH=2的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗步骤f中的XAD‑8树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=2的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28 h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分1；然后用pH=3的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=3的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 ‑6 h后，静置20‑28 h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分2；然后用pH=4的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=4的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 ‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分3；然后，用pH=5的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=5的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28 h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分4；然后用pH=6的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当测得流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=6的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分5；然后用pH=7的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=7的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分6；然后在氮气保护条件下，用pH=8的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=8的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分7；然后在氮气保护条件下，用pH=9的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 mL流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=9的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分8；然后在氮气保护条件下，用pH=10的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=10的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分9；然后在氮气保护条件下，用pH=11的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=11的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4‑6 h后，静置20‑28h，离心得到上层清液，标记为粗提富里酸亚组分10；然后在氮气保护条件下，用pH=12的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=12的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分11；然后在氮气保护条件下，用pH=13的0.1 mol/L焦磷酸钠缓冲液以5‑10倍柱体积/h的速度，淋洗树脂柱，每收集2‑50 ml流出液，用紫外分光光度计在特定波长处测定流出液的吸光值，流出液的吸光值先增大后减小，当流出液吸光值小于最大吸光值的0.5%时，停止pH=13的焦磷酸钠缓冲液淋洗过程，合并流出液，立即酸化至pH= 1，搅拌4 h后，静置24h，离心得到上清液，标记为粗提富里酸亚组分12；步骤h：富里酸亚组分样品的纯化：将上述12份粗提富里酸亚组分分别加入氢氟酸，当每份酸化液中的氢氟酸浓度为0.3 mol/L时，将其静置20‑28 h，然后分别标记为无硅溶液1～无硅溶液12，共计12份无硅溶液；将上述12份无硅溶液分别以5倍柱体积/h流速通过XAD‑8树脂柱进行吸附；吸附完成后，分别用0.65倍柱体积去离子水以15倍柱体积/h的流速淋洗每份无硅溶液对应的XAD‑8树脂柱，弃去流出液，再依次用1倍柱体积0.1 mol/L氢氧化钠溶液和2倍柱体积去离子水以3倍柱体积/h的流速淋洗XAD‑8树脂柱，流出液通过氢离子饱和的氢型阳离子交换树脂交换最终得到的流出液分别标记为富里酸亚组分1～富里酸亚组分12，共计12份富里酸亚组分溶液；将富里酸亚组分1～富里酸亚组分12分别冷冻干燥，最终得到12份固体富里酸亚组分分级样品。