[发明专利]一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。设计一种三功能双链DNA探针，利用DNA甲基转移酶特异性地识别该三功能双链DNA探针发生甲基化，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的双链DNA，甲基化的双链DNA引发链置换反应，释放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量发夹型分子信标底物的切割，引发显著的荧光增强。本发明所述方法可灵敏检测DNA甲基转移酶活性，检测限为0.0082U/mL，并且该方法在研究抗癌药物对DNA甲基转移酶活性的抑制影响和筛选DNA甲基转移酶抑制剂方面具有潜在的应用。

主权项

1.一种非疾病诊断治疗目的的检测DNA甲基转移酶活性的方法，通过链置换反应放大和8‑17 DNAzyme放大DNA甲基转移酶的识别信号；DNA甲基转移酶的作用使得限制性内切酶无法切割探针序列，探针序列通过切割酶依赖的链置换反应扩增出8‑17 DNAzyme，进行信号一级放大；8‑17 DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号，并重新释放8‑17 DNAzyme，进行信号的二级放大；缺少DNA甲基转移酶时，探针序列被限制性内切酶切割，无法进行切割酶依赖的链置换反应，其特征在于所用DNA探针为三功能双链DNA探针，包含用于合成8‑17DNAzyme的原料8‑17 DNAzyme，检测过程包括如下步骤：(1)制备用于进行链置换反应的三功能双链DNA探针，探针包括杂交双链部分和悬垂单链部分，杂交双链部分含有DNA甲基转移酶识别位点，和包含该位点的限制性内切酶的识别位点，垂悬单链部分包括链置换反应切割酶识别的切割位点、用于合成8‑17 DNAzyme的8‑17 DNAzyme互补序列；所述三功能双链DNA探针由两条单链P1和P2退火形成，P1序列对应三功能双链DNA探针的杂交双链部分序列，P1为包括DNA甲基转移酶识别位点的单链，DNA甲基转移酶识别位点区域可被限制性内切酶识别，P2序列按3′‑5′顺序依次为P1互补序列、链置换反应切割酶识别的切割位点、用于合成8‑17 DNAzyme的8‑17 DNAzyme互补序列；(2)加入步骤(1)探针所对应的DNA甲基转移酶孵育，然后加入步骤(1)探针所对应的限制性内切酶进行反应；(3)对步骤(2)反应获得体系进行酶灭活，然后进行切割酶依赖的链置换反应，扩增8‑17 DNAzyme；(4)加入8‑17 DNAzyme识别的分子信标，进行信号检测。