[发明专利]一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法

摘要

本发明公开一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法。该方法包括无菌外植体的获得、绿色球状体的诱导，其诱导通过两个诱导预培养基培养后再经绿色球状体诱导培养基培养，得到绿色球状体，之后，经两个增殖培养基交替培养，再经分化培养、生根培养获得组培苗。本发明成功诱导出珍稀濒危蕨类金毛狗绿色球状体，繁殖效率高，其绿色球状体诱导率达90～94％，增殖倍数达9.5～10.2倍，绿色球状体的分化率达100％，生根率达100％，繁殖周期短，对于珍稀濒危蕨类金毛狗种群数量的扩大，以及对濒危程度的缓解具有重要意义，同时实现了濒危物种种质资源的离体保存。

主权项

一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)金毛狗无菌外植体的获得将金毛狗无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到无菌苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为金毛狗绿色球状体诱导的无菌外植体；(2)金毛狗绿色球状体的诱导①第一次诱导预培养：将步骤(1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅰ，培养5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅰ为：1/4MS～1/2MS+6‑BA 1.0～1.5mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；②第二次诱导预培养：将步骤(2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅱ，培养时间为5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅱ为：1/4MS～1/2MS+2‑ip 0.1～0.3mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；③绿色球状体的诱导：将步骤(2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导培养基，培养条件与步骤(1)相同，培养时间为14天～20天，得到绿色球状体，所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.6～0.8mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(3)金毛狗绿色球状体的增殖每一个增殖周期按以下顺序进行：①第一步增殖培养：将步骤(2)③获得的绿色球状体切割成1～3mm，接种于增殖培养基A，培养18天～21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS～1/2MS+TDZ 0.8～1.2mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；②第二步增殖培养：将(3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基B，培养18天～21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基B为:1/4MS～1/2MS+2‑ip 0.1～0.2mg/L+6‑BA 1.0～1.2mg/L+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(4)金毛狗绿色球状体的分化将步骤(3)②第二步增殖培养增殖后的绿色球状体分割为直径1～3mm的球状体，接种于分化培养基，培养28天～29天，得到分化幼苗，培养条件与步骤(1)相同，所述分化培养基为：1/6MS～1/4MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；(5)生根培养将步骤(4)得到的分化幼苗接种于生根培养基，分化幼苗生根后即为金毛狗组培苗，培养条件与步骤(1)相同，所述生根培养基为：1/2MS+活性炭1～2g/L+水解酪蛋白200～300mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂浓度7.0g/L，pH为5.80。