[发明专利]内切型β琼胶酶AgaA的制备方法

摘要

内切型β琼胶酶AgaA的制备方法，涉及琼胶酶。1)琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92的发酵；2)琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析；3)AgaA粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化；4)AgaA次级酶液经CM琼脂糖离子层析纯化。从Flammeovirga sp.SJP92的发酵液中分离纯化获得内切型β琼胶酶，建立了其分离纯化工艺。纯化后的酶纯度高、活力好，为该酶能广泛应用于生物、食品、医药等研究领域奠定基础。

主权项

1.内切型β琼胶酶AgaA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92的发酵，其具体方法如下：挑取Flammeovirga sp.SJP92单菌落于2216E培养基中，32℃下200r/min培养12h，即为种子液，添加1％的种子液于含0.2％琼胶粉的2216E培养基中，32℃下200r/min发酵培养42h，即为发酵液；所述2216E培养基的成分为2％氯化钠，0.3％六水氯化镁，0.6％七水硫酸镁，0.1％硫酸铵，0.02％碳酸氢钠，0.03％二水氯化钙，0.05％氯化钾，0.042％磷酸二氢钾，0.005％溴化钠，0.002％六水氯化硒，0.001％柠檬酸铵铁，0.1％酵母粉和0.5％蛋白胨，pH为7.6；所述含0.2％琼胶粉的2216E培养基由2216E液体培养基加入0.2％琼胶粉配制而成；2)琼胶酶菌株Flammeovirga sp.SJP92发酵液的硫酸铵盐析，其具体方法如下：Flammeovirga sp.SJP92的发酵液13000r/min离心收集上清，在冰浴条件下，往发酵液上清添加硫酸铵固体粉末至饱和度为40％，硫酸铵粉末添加过程中边添加边搅拌，硫酸铵粉末溶解完全后，4℃静置2h，13000r/min离心30min，收集上清，继续往发酵液上清添加硫酸铵固体粉末至饱和度为80％；待硫酸铵粉末溶解完全后，4℃静置过夜，13000r/min离心30min，收集沉淀，沉淀用20mM，pH值为7.8的Tris.HCl缓冲液溶解，并置于同样的缓冲液中透析，共透析3次，每次3h，透析后的酶液即为AgaA的粗酶液；3)AgaA粗酶液经DEAE琼脂糖离子层析纯化，其具体方法如下：去除DEAE琼脂糖离子填料的保存液，加入双蒸水，混匀成胶浆，静置至填料沉淀，去除上清，用双蒸水漂洗填料5遍，完全去除填料的保存液；往填料中加入20mM，pH值为7.8的Tris·HCl缓冲液，混匀成胶浆，重新静置至填料沉淀，去除上清，用20mM，pH值为7.8的Tris·HCl缓冲液平衡填料5遍，充分平衡DEAE琼脂糖离子填料；将平衡好的DEAE琼脂糖离子填料加入AgaA粗酶液，颠倒混匀1h，3000r/min离心，取上清，即为AgaA的次级酶液；4)AgaA次级酶液经CM琼脂糖离子层析纯化，其具体方法如下：去除CM琼脂糖离子层析填料的保存液，加入双蒸水，混匀成胶浆，静置至填料沉淀，去除上清，用双蒸水洗填料5遍，完全去除填料的保存液；往填料中加入20mM，pH值为7.8的Tris·HCl缓冲液，混匀成胶浆，重新静置至填料沉淀，去除上清，用20mM，pH值为7.8的Tris·HCl缓冲液平衡填料5遍，充分平衡CM琼脂糖离子填料；将平衡好的CM琼脂糖离子层析填料加入AgaA次级酶液，颠倒混匀1h，3000r/min离心，取沉淀，沉淀用20mM，pH值为7.8的Tris.HCl缓冲液混匀成胶浆装柱；用氯化钠浓度为0～0.3M的梯度洗脱液线性梯度洗脱，洗脱速度为1.47mL/min，每管收集5mL；测定各管收集液的琼胶酶活力，并绘制酶活曲线；根据酶活曲线，将具有琼胶酶活力的各管收集液合并，置于3KDa超滤管中6000r/min离心浓缩，浓缩液即为AgaA的纯酶液；所述Flammeovirga sp.SJP92β‑琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10071。