[发明专利]一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物及其筛选方法

摘要

本发明涉及一种北方常见蛏类线粒体cox2基因扩增引物及其筛选方法，分为五步a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox2序列；b、将下载的序列用软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件设计多对引物，送交上海生工生物技术有限公司合成；d、将大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物cox2CF和cox2CR。本发明筛选出一对引物具有条带单一、扩增效率高的特点，有助于快速获得线粒体基因组全长，满足蛏类遗传多样性、系统发生学研究的需要。

主权项

一种蛏类线粒体cox2基因的扩增引物的筛选方法，其特征在于包含以下步骤：a、下载序列：登陆美国国立生物技术信息中心，下载大竹蛏、长竹蛏、缢蛏线粒体全序列中的cox2序列；b、序列比对：将下载的序列用BioEdit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、引物设计与合成：在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，送交有合成能力的机构合成；d、DNA提取：对采集的大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏和缢蛏个体提取DNA，加双蒸水稀释为100 ng/μl的工作液备用；e、引物扩增：然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况：在10μl PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这些个体的cox2片段，该反应体系包括100 ng模板DNA，0.25 U Takara 公司生产的 Taq 聚合酶，富含Mg2+的1×PCR buffer，0.2 mM dNTPs，引物各1 μM；PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45s，46‑54 ℃退火45s，72 ℃延伸45s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min；所述引物为一对，分别是cox2CF和cox2CR：cox2CF为5’ AAATTTRATTTTYTWTCATGAT 3’； cox2CR为5’ GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3’；所述引物的最佳退火温度为50℃，产物片段长度 570bp。