[发明专利]霍山石斛组织培养一步成苗的方法及使用的营养液的配方

摘要

一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法，包括下述步骤固体培养基的制备，其中固体营养基的配方包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、激素以及添加物；液体营养液的制备液体营养液的配方按照固体培养基的配方，不添加激素、琼脂、矮壮素和香蕉苹果提取液；霍山石斛果荚的选择和消毒；霍山石斛种子悬浮液的制备；无菌播种；种苗培养；出苗。采用上述方法进行霍山石斛的培育的优点在于缩短了霍山石斛的培养周期，6个月可以出苗，即在种子成熟的10月份播种，第二年的4月份就可以出苗，刚好赶在栽苗期；降低了50％的霍山石斛组培育苗的生产成本，减少了种植投入；增加栽培的成活率和发芽率。

主权项

一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法，其特征在于：包括下述步骤：步骤一：固体培养基的制备，其中固体营养基的配方包括：以下组成及配比的大量元素：硝酸钾KNO3：300～500mg/L；硫酸铵(NH4)2SO4：400～600mg/L；磷酸二氢钾KH2PO4：300～500mg/L；硫酸镁MgSO4.7H2O：200～300mg/L；硝酸钙Ca(NO3)2：400～500mg/L；以下组成及配比的微量元素：碘化钾KI：0.65～0.95mg/L；硼酸H3BO3：5.3～8.9mg/L；硫酸锰MnSO4.4H2O：19～25mg/L；硫酸锌ZnSO4.7H2O：6.5～9.8mg/L；钼酸钠Na2MoO4.2H2O：0.10～0.45mg/L；硫酸铜CuSO4.5H2O：0.010～0.035mg/L；氯化钴CoCl2：0.010～0.035mg/L；以下组成及配比的铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA：25.5～40.5mg/L；硫酸亚铁FeSO4.7H2O：22.5～30.5mg/L；以下组成及配比的有机成分：肌醇C6H12O6：90～110mg/L；甘氨酸C2H5NO2：1～3mg/L；盐酸硫胺素VB1：0.05～0.15mg/L；盐酸吡哆醇VB6：0.4～0.6mg/L；烟酸VB5或VPP：0.4～0.6mg/L；以下组成及配比的激素：萘乙酸NAA：0.6～0.9mg/L；6‑苄氨基嘌呤6‑BA：0.4～0.6mg/L；以下组成及配比的添加物：蔗糖：25～35g/L；琼脂：3.5～5.5mg/L；花宝1号：1.5～2.5mg/L；香蕉苹果混合提取液2～4:1～2：120～200g/L；所述固体培养基的生产流程包括：水加热沸腾后，加入上述配方的琼脂，形成琼脂初混液，将上述组成及配比的添加物加水加热粉碎并浸出形成添加物浸出液，该添加物浸出液与上述琼脂初混液混合形成琼胶液，在该琼胶液内按上述组分和配方加入大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、激素，然后搅拌均匀，形成培养基初液，调节ph值至5.6‑6.0，温度维持在50℃到70℃之间进行分装，分装后100℃～150℃灭菌10min～30min备用；步骤二：液体营养液的制备：液体营养液的配方按照固体培养基的配方，不添加激素、琼脂、花宝1号和香蕉苹果提取液，所述液体营养液的生产流程包括：水加热沸腾后，按照液体营养液的配方加入各组分，混合定容后，调节ph值至5.6‑6.0，温度维持在50℃到70℃之间进行分装，分装后100℃～150℃灭菌10min～30min备用；步骤三：霍山石斛果荚的选择和消毒：选择当年成熟饱满的霍山石斛硕果，表面无病斑、虫蛀和开裂，将采收的霍山石斛硕果进行清理，去除硕果表面枯萎的残花，并用清水反复冲洗，然后放入75％的酒精中至淹没为止，浸泡20min～50min，然后放在无菌的接种盘中在无菌操作台上晾干，备用；步骤四：霍山石斛种子悬浮液的制备：无菌室超净工作台面上，用手术刀在硕果的一端切开一个小口子，用镊子夹住果柄，将切口对准瓶口，用另一只镊子轻轻敲打夹住果柄的镊子，将种子均匀的散落营养液中，并在无菌的环境下用磁力搅拌器将悬浮液搅拌均匀，并用悬浮计数法在显微镜下用计数板检测种子在悬浮液的密度，要求达到80～120粒/ml的密度；步骤五：无菌播种：在无菌操作台上，用灭菌后的移液枪从种子悬浮液中抽取1ml，放入固体培养基中，盖好瓶盖缓慢晃动，直至瓶内的悬浮液均匀的平铺在培养基表面为止，放入培养框中，送至培养室培养；步骤六：种苗培养，刚开始10天是种子萌发阶段，采用暗培养，无光照，温度控制在24℃～27℃，10天‑70天，为发芽阶段，这一时间段内，保证光照时间7～9小时，光照强度1500lux‑2000lux，温度控制在25℃～28℃，70天～120天，为发生根阶段，这一时间段内，保证光照时间9～12小时，光照强度1800lux‑2100lux，温度控制在24℃～27℃，120天～180天，为壮苗阶段，这一时间段内，保证光照时间9～12小时，光照强度2500lux‑3000lux，温度控制在24℃～27℃；在培养过程中，若发现固体培养基被种苗吸收完不能够满足种苗继续生长需要时，用无菌移液枪在无菌操作台上将灭菌后的液体营养液加至培养瓶中，供应种苗继续生长；步骤七：出苗。