[发明专利]一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法

摘要

本发明公开了一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，本发明利用沿阶草EMS体细胞诱变结合体细胞胚再生可实现短时间内获得大量多种多样的同质突变体，避免嵌合体的形成，容易产生表型可见并且遗传稳定的同质突变体库。所以此项发明不但在短时间内可快速地构建起沿阶草EMS同质突变体库，而且有利于今后沿阶草功能基因组学、遗传育种与生理发育等问题系统深入的研究，同时也为选育沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

主权项

1.一种沿阶草EMS同质突变体库快速构建的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5‑1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；所述无菌培养基为1/2MS + 2.0 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA +20g/L蔗糖+0.7% 琼脂；2）早期体细胞胚外植体的培养：切取所述再生植株的叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25‑28℃无菌室暗培养7‑10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；所述体胚发生诱导培养基为MS+0.2 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg /L 2，4‑二氯苯氧乙酸+30g/ L蔗糖+3.5g/L phytagel；3) 化学诱变剂准备：包括不同浓度EMS溶液准备；4) 早期体细胞胚外植体的EMS处理：将早期体细胞胚外植体先分成6个大组，每个大组再分成3份，6个大组用于0.0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%6个不同浓度的EMS诱变剂的处理；每个大组分成的3份分别用于3个不同浸泡时间的处理；EMS溶液浸泡处理时间分为：1.0小时、1.5小时和2.0小时；5) 体细胞胚分化培养：将经EMS诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新接种于体胚发生诱导培养基继续在温度为25‑28℃无菌室暗培养至50‑60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；6) 突变胚状体快繁增殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25‑28℃光下培养50‑60d，中间继代一次，可获得大量成熟的突变胚状体；所述体细胞胚快繁增殖培养基为MS + 2mg/L BA + 0.2mg/L NAA +40g/L蔗糖+3.5g/L phytagel，光照强度为1500‑2000lx，光照时间为每天10‑14小时；7) 成熟突变胚状体再生植株：将成熟突变胚状体转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25‑28℃光下培养20‑25d，获得具根、茎、叶完整的再生植株；所述植株再生培养基为1/2 MS+20g/L白糖+ 0.7%琼脂；8) 突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1‑1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；9) 田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草理化饱和突变体库。