[发明专利]一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法

摘要

本发明公开了一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法。甲基磺酸乙酯和⁶⁰Co‑γ射线是应用最广泛，即高效又稳定的理化诱变剂。其中EMS可在一个基因组上产生多个点突变，产生的突变可随机分布于整个基因组，且分布均匀，密度高，成本低，有利于等位基因突变体的获得，特别是较小的突变群体便可获得饱和的突变体库；而r射线诱变主要是引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功能缺失的突变体库的创建；所以这两种方法同时使用，通过优势互补，既可以增加突变体库的容量，又能满足饱和突变体库的要求，更加丰富了饱和突变体库的内容，而且所获得的突变体不涉及转基因事件，所以安全性高、便于应用。

主权项

1.一种高效快速构建沿阶草饱和高抗同质突变体库的优化方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5‑1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基上培养50‑56d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基上光下培养50‑60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生各个发育时期的胚状体，将胚状体转入无激素的成苗培养基培养，20‑25天后形成完整再生植株，以其作为高频体细胞胚材料来源；所述无菌培养基为1/2MS + 2.0 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA +20g/L蔗糖+0.7% 琼脂；所述体胚发生诱导培养基为MS+0.2 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg /L 2，4‑二氯苯氧乙酸+30g/ L蔗糖+3.5g/L phytagel，所述高频体细胞胚培养基为MS +2mg/L BA + 0.5mg/L NAA +40g/L蔗糖+3.5g/L phytagel，所述成苗培养基为MS+白糖30g/ L +0.7%琼脂；2)早期体细胞胚的培养：切取上述再生植株的叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上培养7‑10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；所述体胚发生诱导培养基为MS+0.2 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg /L 2，4‑二氯苯氧乙酸+30g/ L蔗糖+3.5g/L phytagel；3) γ射线和EMS理化诱变剂准备：包括⁶⁰Co‑γ射线源准备及辐射剂量的设置和不同浓度EMS溶液准备；辐射剂量和EMS溶液浓度：辐射剂量设置为0Gy、5Gy、10Gy、15Gy 、 20Gy、25Gy 6个不同处理；EMS溶液配制成0、0.3% 和0.6% 3个不同浓度；4) 早期体细胞胚的γ射线和EMS复合处理：将早期体细胞胚先分成6个大组用于6个不同剂量γ射线处理，每个大组待γ射线处理结束后，再分成3份用于3个不同浓度EMS诱变剂的处理；5)细胞突变体筛选处理：将上述经γ射线和EMS复合处理过的早期体细胞胚分成2大类分别编号，取其中1大类进行低温筛选处理，即放入5‑8℃低温无菌培养箱中暗培养7‑10d；6) 体细胞胚分化培养：将2大类早期体细胞胚即经低温筛选处理和未经低温筛选处理的均转移到温度为25‑28℃无菌室暗培养50‑60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期同质突变胚状体；7）同质突变胚状体快繁增殖培养：将上述早期同质突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25‑28℃光下培养50‑60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；所述体细胞胚快繁增殖培养基为MS + 2mg/L BA + 0.2mg/L NAA +40g/L蔗糖+3.5g/L phytagel，光照强度为1500‑2000lx，光照时间为每天10‑14小时；8)成熟同质突变胚状体的耐冷性筛选及快繁增殖培养：取上述经低温筛选并经快繁增殖的那1类成熟同质突变胚状体，切成0.5cm大小块，分别编号接种于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5‑8℃低温无菌培养箱中弱光下500‑800lx培养25‑30d后，再继代转入25‑28℃光下1500‑2000lx培养25‑30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；9) 成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁增殖的具丰富变异的成熟同质突变胚状体及抗冷性较强的成熟同质突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25‑28℃光下培养20‑25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；植株再生培养基为1/2 MS+20g/ L白糖+ 0.7%琼脂；10）同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1‑1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；11)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的过程中进行突变体筛选、种质遗传多样性鉴定，以此高效快速构建起沿阶草理化诱变饱和高抗同质突变体库。