[发明专利]一种副猪嗜血杆菌菌株五价灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种副猪嗜血杆菌菌株，所述菌株为副猪嗜血杆菌菌株LYW1(Haemophilus parasuis)，于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.11146。菌株LYW1能够用于参与制备防治多种血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病的疫苗，最终所制得的疫苗安全性及防治能力均良好。

主权项

1.一种副猪嗜血杆菌菌株五价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，方法如下：繁殖培养：取副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株LYW1；所述LYW1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11146；副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株LYD1；所述LYD1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.11143；副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株LYH5；所述LYH5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11144；副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株LY02；所述LY02保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11145；副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)菌株LYC2；所述LYC2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.11147；将菌株LYD1、菌株LYH5、菌株LY02、菌株LYW1和菌株LYC2分别划线接种于TSA琼脂平板上，且于5％～10％CO2、37℃下培养24～48h，挑取典型菌落并接种于TSB培养基上，置于37℃振荡培养24～48h，即得菌株LYD1的一级种子液、菌株LYH5的一级种子液、菌株LY02的一级种子液、菌株LYW1的一级种子液及菌株LYC2的一级种子液；取所得菌株LYD1的一级种子液、菌株LYH5的一级种子液、菌株LY02的一级种子液、菌株LYW1的一级种子液及菌株LYC2的一级种子液并分别划线于TSA琼脂平板上，且于5％～10％CO₂、37℃下培养24～48h，挑取典型菌落并接种于TSB培养基上，置于37℃振荡培养24～48h，即得菌株LYD1的二级种子液、菌株LYH5的二级种子液、菌株LY02的二级种子液、菌株LYW1的二级种子液及菌株LYC2的二级种子液；将菌株LYD1的二级种子液、菌株LYH5的二级种子液、菌株LY02的二级种子液、菌株LYW1的二级种子液及菌株LYC2的二级种子液分别接种至发酵培养基，并于37℃、180r/min下培养22～24h，得菌株LYD1菌液、菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液、菌株LYW1菌液及菌株LYC2菌液；浓缩与灭活：将繁殖培养所得各菌液分别进行浓缩，且菌株LYD1菌液、菌株LYW1菌液、菌株LYC2菌液均浓缩至菌液中的抗原含量为2.5×10⁹CFU/mL，菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液则均浓缩至菌液中的抗原含量为2.0×10⁹CFU/mL；接着将浓缩后的各菌液分别进行灭活；总混合菌液的制备：取已浓缩、灭活后的菌株LYD1菌液、菌株LYW1菌液及菌株LYC2菌液并按1:1:1的体积比混合，获得第一混合菌液；取已浓缩、灭活后的菌株LYH5菌液、菌株LY02菌液并按1:1的体积比混合，获得第二混合菌液；之后将所得第一混合菌液与第二混合菌液按1:1.5的体积比混合则得总混合菌液；水相配制：按体积份取已灭菌的吐温‑804份、无菌检验合格的总混合菌液96份，并导入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温‑80完全溶解，获得水相；油相配制：按体积份取注射用白油94份、司本‑806份并加至油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，125℃加热30min，冷却后即得油相；乳化：取油相1.5体积份置于乳化罐内，开动电机1500‑2000r/min搅拌，同时缓缓加入水相1体积份，再以4000r/min乳化30min；乳化后，取样10ml并以3000r/min离心15min，若不分层则乳化所得乳化液即为所述副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗；若有分层现象则将所得乳化液重复乳化直至不分层，最终即得所述副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗；所述TSA平板琼脂的配制方法为：取胰蛋白大豆琼脂40g，加入去离子水定容至1000mL，充分摇匀溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入50mL过滤除菌的新生牛血清、200μL过滤除菌的0.2g/mLNAD即可；所述TSB培养基的配制方法为：取胰蛋白大豆肉汤即TSB30g溶于去离子水，定容至1000mL，充分摇匀溶解后121℃蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的新生牛血清、200ul过滤除菌的0.02％NAD即可；所述发酵培养基为半合成培养基，该半合成培养基的配制方法为：取TSB30g溶于去离子水，并定容至1000mL，充分摇匀溶解后于121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入50mL过滤除菌的新生牛血清、200μL过滤除菌的0.02％NAD即可。