[发明专利]一种生物磁分离筛选抗真菌活性抗菌肽的方法

摘要

本发明公开了一种生物磁分离筛选抗真菌活性抗菌肽的方法，属于生物活性肽的制备纯化领域；本发明以食源性蛋白为原料，利用蛋白酶对食源性粗蛋白进行酶解，制备出含抗真菌肽的组分，再利用磁性真菌细胞膜脂质体的生物磁分离结合高效液相指纹图谱技术，快速富集和分离纯化苦荞粗蛋白水解抗真菌活性抗菌肽；本发明采用磁性真菌细胞膜脂质体富集抗真菌活性抗菌肽，整个分离过程主要涉及生物磁分离和RP-HPLC两个步骤，与传统的蛋白酶释放、离子交换柱层析、凝胶过滤及反相层析等繁琐抗菌肽筛选步骤相比，具有最大限度模拟抗菌肽与真菌细胞膜作用的生理条件、快速高效、温和准确、操作简单的优点。

主权项

一种生物磁分离筛选抗真菌活性抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤：  （1）调节食源性蛋白原料粉与石油醚的料液比为1:4～1:8，用石油醚回流脱脂3～6h得脱脂原料粉，在脱脂原料粉中添加蒸馏水，调节脱脂原料粉的料液比1:6～1:20，pH值至7.0～9.0，在4～25℃、300～500rpm条件下提取蛋白1～12h后，在4～25℃下8000～10000g离心15～30min取上清液，调节上清液pH至3.5～4.5沉淀蛋白，蛋白沉淀用水洗2～3次，加水混合调 pH至中性后，置于‑80℃超低温冰箱中预冻2～6h，在‑55～‑45℃、压力0.03～0.2mBar下冻干24～72h即得粗蛋白，4℃保存备用；  （2）制备质量百分比3～6%的粗蛋白水溶液，在溶液中添加蛋白酶，在30～70℃、pH2.0～9.0下酶解1～4h后，100℃煮沸5～10min灭酶，在4～25℃下，8000～10000g离心10～30min取上清液，对上清液进行抗菌活性测定，取活性好的上清液用截留分子量为 5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的粗蛋白酶解抗真菌抗菌肽溶液，冻干即得抗真菌混合肽粉末，‑20℃保存备用；  （3）将磷脂酰胆碱与麦角固醇以质量比1～3:1的比例溶于无水乙醚中，冰浴间歇超声10～50 min使溶液均一，加入直径为50～100nm的磁性Fe₃O₄，4～10℃轻微振结合20～80min后旋转蒸发除去溶剂，通入氮气10～50min除净乙醚即为磁性真菌细胞膜脂质体；  （4）将步骤（2）抗真菌混合肽粉末配置成浓度5～20mg/mL的肽溶液，与步骤（3）的磁性真菌细胞膜脂质体混合置于离心管中分散，在 20～37℃下震荡孵育20～60min，磁分离架将分散的磁性真菌细胞膜脂质体聚集，溶液即为抗真菌混合肽结合真菌细胞膜脂质体液；  （5）利用高效液相技术检测抗真菌混合肽结合真菌细胞膜脂质体液和抗真菌混合肽液的指纹图谱，收集两者在相同保留时间峰形或峰面积变化的差异峰，该差异峰抗菌肽即为抗真菌活性抗菌肽。