[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的壳五聚糖及其制备方法

摘要

本发明提供了一种亚硝酸钠化学裂解法制备壳五聚糖的方法，同时应用超滤、凝胶柱分离、透析等多种手段分离出纯度较高的壳五聚糖产物。并应用了LC-MS和核磁共振氢谱验证了结构。本发明中的壳五聚糖对多种肿瘤细胞如人肝癌细胞(BEL-7402)、胃癌细胞(BGC823)和肺癌细胞(A549)的增殖和生长都具有较强的抑制作用。为研究海洋一类新药提供了基础。

主权项

一种具有抗肿瘤活性的壳五聚糖制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1).取甲壳索多糖纯品用水溶解后制成5％～10％的溶液，用醋酸调节pH值2.0～4.0，添加亚硝酸钠控制反应体系中亚硝酸钠浓度为0.1mol/L～0.8mol/L，控制反应温度25℃～50℃，反应时间为4～8小时。(2).用氢氧化钠或氨水碱调节裂解液控制pH值为6.0～7.5。再向其中加入3～5倍体积乙醇进行醇沉，4℃防爆冰箱静置过夜，高速离心得沉淀物，用少量乙醇洗涤沉淀，最后冻干得到淡黄色裂解产物。(3).将裂解产物溶解后制成10％～20％的溶液，用冰醋酸调节pH值为4，过40～60μm滤膜除不溶解颗粒物杂质。DEAE‑FF树脂活化预处理后装到合适大小的柱子中。柱子先用缓冲液A(50mM氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)预平衡。滤液加载到柱子上，柱子用三倍体积的缓冲液A冲洗。之后用缓冲液B(1M氯化钠，20mM乙酸钠，pH4)将甲壳素多糖从柱子上洗脱下来，收集洗脱液。(4).将洗脱液过1500～2000D的超滤膜，去除部分未裂解的甲壳素多糖，得到超滤液然后浓缩、冻干后得超滤产物。(5).将超滤产物溶解在水中制备成30％～50％的水溶液，然后装入截留分子量为300～500Da的透析袋中，流水透析除盐。(6).将透析产物收集后浓缩过分子筛层析柱，分离不同分子量的甲壳素寡糖片段。分子筛层析柱填料为生物胶Bio‑Gel P2～P4。