[发明专利]一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法

摘要

本发明公开了一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法，属于生物技术领域。本发明通过使用无微生物DNA污染的二次蒸馏水并配制所需试剂，采用1.2M蔗糖漂浮沉淀法对卵囊进行纯化，纯化后的卵囊经15％次氯酸钠溶液和细胞裂解液双重处理，充分裂解残留的细菌等杂质，再通过TE和二次蒸馏水反复漂洗去除粘附于卵囊壁的外源菌DNA。研究表明，经本发明方法处理后的卵囊纯度高，所抽提的基因组DNA经PCR检测无外源菌DNA污染，且整个过程操作简单，成本低，并对卵囊不产生任何影响。本发明的提出对球虫卵囊高纯度基因组DNA提取、基因克隆、全基因组(重)测序，以及表观遗传调控的研究具有重要意义。

主权项

1.一种无外源菌DNA污染的球虫卵囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）置孢子化卵囊于离心管中离心，弃上清；（2）卵囊沉淀用PBS离心漂洗2次；（3）卵囊沉淀用1.2 M蔗糖漂浮1次，离心，收集上清液；（4）上清液用二次蒸馏水稀释，离心，弃上清；（5）卵囊沉淀用0.3 M蔗糖漂洗2次，离心，弃上清；（6）卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；（7）卵囊沉淀用体积百分数为15%的次氯酸钠溶液处理10‑20 min，期间多次震荡，得到卵囊的悬浮液，离心，弃上清；（8）卵囊沉淀用PBS离心漂洗3次，弃上清；（9）卵囊沉淀加入Cellytic M细胞裂解液剧烈涡旋10‑60 s，室温静置，离心，弃上清；（10）卵囊沉淀用TE离心漂洗2次，弃上清；（11）卵囊沉淀用二次蒸馏水离心漂洗1次，弃上清；（12）卵囊沉淀用PBS离心漂洗1次，弃上清，沉淀即为纯化好的卵囊；方法中所用到的试剂均采用自制的二次蒸馏水制备，所述的二次蒸馏水是通过利用石英自动亚沸高纯水蒸馏器对实验室常规超纯水进行二次蒸馏以及高压灭菌后得到的；其中，步骤（1）、步骤（2）、步骤（4）以及步骤（6）‑步骤（12）中所述的离心是指以3000 rpm离心10 min，步骤（3）以及步骤（5）中所述的离心是指以2000 rpm离心10 min。