[发明专利]用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法

摘要

本发明涉及用于在木霉属的蛋白酶缺陷突变体中产生多肽的方法，具体涉及亲本木霉属菌株的突变体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽和一个或多个选自下组的基因：第一和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一和第二天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，其中一个或多个基因经修饰使得突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本木霉属菌株，分别在一种或多种选自下组的酶的产生方面有缺陷：第一和第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，第一和第二天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。本发明还涉及产生此类突变体中的多肽的方法，和用于产生此类突变体的方法。

主权项

1.一种亲本里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株的突变体，所述亲本里氏木霉菌株包含第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述突变体包含编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽对于所述亲本里氏木霉菌株是外源的；其中/n所述亲本里氏木霉菌株中的第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、所述第一天冬氨酸蛋白酶基因、所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因和所述第二天冬氨酸蛋白酶基因经修饰以获得所述突变体，所述突变体菌株当在相同条件下培养时，相对于亲本里氏木霉菌株，在第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、第一天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和第二天冬氨酸蛋白酶的产生方面有缺陷；/n(i)其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：/n(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或其成熟多肽具有至少99％同一性；/n(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID NO:1或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少99％序列同一性；/n(ii)其中所述第一天冬氨酸蛋白酶选自下组：/n(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少99％同一性；/n(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID NO:3或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少99％序列同一性；/n(iii)其中所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：/n(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少99％同一性；/n(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID NO:5或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少99％序列同一性；/n(iv)其中所述第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶选自下组：/n(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:100或其成熟多肽具有至少99％同一性；/n(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID NO:99或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少99％序列同一性；/n(v)其中所述第二天冬氨酸蛋白酶选自下组：/n(a)多肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:108或其成熟多肽具有至少99％同一性；/n(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID NO:107或其cDNA，或它们的成熟多肽编码序列具有至少99％序列同一性；和/n其中所述第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、第一天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和第二天冬氨酸蛋白酶源自里氏木霉。/n