[发明专利]沙地云杉体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明为一种沙地云杉体细胞胚胎发生的方法，属于植物栽培领域种苗技术，具体的讲是利用沙地云杉成熟胚诱导体细胞胚胎发生的方法。本发明采用完全成熟的沙地云杉种子，剥取成熟胚为外植体材料，接种到愈伤诱导培养基上培养，两次继代后产生胚性愈伤，将上述愈伤增殖从而能达到扩繁目的，再由胚性愈伤分化产生体细胞胚，体细胞胚经干化处理后正常萌发：本发明的优点是，采用本发明所述的沙地云杉成熟胚诱导体细胞胚胎发生，获得了大量的沙地云杉体细胞胚，摆脱了以幼胚作为外植体而产生的季节上的瓶颈，实现沙地云杉的快速繁殖。

主权项

一种沙地云杉体细胞胚胎发生的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将成熟的沙地云杉种子用清水浸泡12～15h，将漂浮于液面的种子舍弃，余下的种子用自来水冲洗3～4次；在超净工作台中，将云杉种子先用70～75%酒精浸泡28～32s后用无菌水清洗3～5次,再用2%次氯酸钠溶液消毒12min,然后用无菌水冲洗3～5次；（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：LM培养基+6‑BA（2～5mg/L）+2,4‑D（4～8mg/L）+KT（0.5～2.0mg/L）+蔗糖（30g/L）+结冷胶（2g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行诱导培养20～25d生成愈伤组织；（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：1/2～1/4LM培养基+6‑BA（1～4mg/L）+2,4‑D（1～5mg/L）+ KT（0.1～1.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20～25d使愈伤组织进一步生长；（4）将步骤（3）所述的愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+6‑BA（1.0～1.9mg/L）+2,4‑D（1.0～1.9mg/L）+ KT（0.1～0.5mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行继代培养20～25d,得到淡黄色紧密结构的非胚性愈伤组织与白色半透明丝状的胚性愈伤；（5）将步骤（4）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+6‑BA（0.1～1.0mg/L）+2,4‑D（1.0～3.0mg/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔20～25d以相同配方继代培养进行增殖；（6）将步骤（5）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：1/2～1/4LM培养基+ABA（15～20mg/L）+PEG4000（40～50g/L）+蔗糖（20～30g/L）+结冷胶（2～4g/L），pH控制在5.6～5.8、温度为22±2℃、暗条件下进行分化培养，每隔20d以相同配方进行继代培养；40～60d后即长出云杉体细胞胚；（7）将步骤（6）所述的体细胞胚接种于1/2～1/4LM培养基+蔗糖（20～40g/L）+结冷胶（3～7g/L）+PEG4000（50～80g/L）培养7d以上，将体胚平铺于两层湿润的滤纸上，放在一个无菌培养皿中干化处理7天，每个培养皿放置约150个体细胞胚，以上过程均在培养温度为22±2℃、光照条件为1200Lx、光照时间为14h/d的条件下进行从而达到干化目的；（8）将步骤（7）所述的完成干化的体细胞胚接种于1/4～1/2LM培养基+蔗糖（20～30g/L）+琼脂（5～8g/L）,30d后即可萌发并长成带根的键壮云杉幼苗。