[发明专利]一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法

摘要

本发明涉及一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法。该方法包括采用液体深层发酵法培养鼎湖鳞伞菌，菌丝体用去离子水冲洗三次，经干燥、粉碎、热水浸提、乙醇沉淀、复溶、冷冻干燥得菌丝体多糖；发酵液经滤膜分离、减压浓缩、乙醇沉淀、复溶、冷冻干燥得胞外多糖。体外清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的实验表明鼎湖鳞伞菌胞外多糖具有一定的体外抗氧化活性。本发明综合利用鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖，具有利用率高、工艺温和、成本低等优点，为开发利用药用真菌资源开辟了新的途径。

主权项

一种液体发酵制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)将鼎湖鳞伞菌种在马铃薯斜面培养基上于隔水式恒温培养箱中28℃培养8‑10天，直至菌丝长满斜面。(2)从马铃薯斜面培养基上挑取0.5cm²大小的母种块，接种于种子培养基中，于28℃静止培养12小时后，150rpm下振荡培养10‑15天。种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，蛋白质胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1；装液量为100mL/250mL。(3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15％(V/V)，于28℃、120rpm的条件下培养10‑15天，发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖45；酵母膏6，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.5，马铃薯100，麦芽粉2.5；装液量为200mL/500mL。(4)将发酵产物用滤纸进行减压过滤，得到鼎湖鳞伞菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用去离子水冲洗三次，55℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，用去离子水以料液比1∶10，于90℃热水浴中提取3小时，滤渣重复提取一次，合并提取液；将菌丝体提取液和发酵液分别经4000rpm离心15min，取上清，真空浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积的酒精，充分混匀，4℃下静置过夜，4000rpm离心20min，收集粗多糖沉淀，依次用丙酮和无水乙醚各洗涤两次，复溶后真空冷冻干燥，得鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖。液体发酵法制备鼎湖鳞伞菌胞内、胞外粗多糖产量分别为429mg/L和930mg/L。(5)粗多糖溶解液上样于DEAE Sepharose Fast Flow(2.0×60cm)，并分别用去离子水、0.1mol/L NaCl和0.3mol/L NaCl进行洗脱收集，流速为2mL/min。采用硫酸‑苯酚法检测洗脱液中的多糖含量，合并相同组分，50℃旋转蒸发浓缩，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，分别得胞内、胞外多糖组分。(6)将步骤(5)所得胞内、胞外多糖组分经Sephadex G‑100凝胶柱纯化后得胞内、胞外纯化多糖组分，并配制成一系列浓度溶液，测定其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力。制备的鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有一定的清除能力。