[发明专利]软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法，属于生物组织工程技术。本发明用人、猪、牛或羊关节软骨制备出软骨细胞外基质，用桑蚕丝制备丝素蛋白，按特定比例混匀后在一定温度下定向结晶，冷冻干燥后首先经紫外线交联，再经碳化二亚胺及N‑羟基琥珀酰亚胺或戊二醛、京尼平交联而成。这样设计的本发明，生物相容性好，避免发生免疫排斥反应；组成结构及力学性能与人软骨细胞外基质相似；且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单，可用于构建组织工程软骨修复软骨退变，具有良好的临床应用前景。

主权项

1.一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述支架由软骨细胞外基质和丝素蛋白交联而成，孔隙结构为取向结构，该方法包括以下步骤：a.制备软骨细胞外基质冻干海绵①切取关节软骨片,用含有苯甲基磺酰氟的Tris‑HCl缓冲液浸泡后粉碎为匀浆；②差速离心法取500nm‑5μm的软骨微丝；③0～4℃下加入含TritonX‑100和苯甲基磺酰氟的Tris‑HCl缓冲液震荡12～24h；④离心，蒸馏水反复冲洗；再离心，加入DNaseI与RNase A再次震荡消化12～24h；⑤离心，超纯水反复冲洗，冷冻干燥；b.制备丝素蛋白溶液①蚕丝脱胶:将蚕丝扯松放于Na2CO3溶液中煮沸30～60min；冲洗，用Na2CO3溶液继续煮沸30～60min，冲洗，晾干；②取脱胶后的蚕丝溶于LiBr溶液，50～80℃下搅拌2～8h，制得丝素蛋白混合溶液；③将丝素蛋白混合溶液装入透析袋中进行透析；④将透析后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm离心，上清液装入透析袋中再次透析，加入聚乙二醇溶液进行浓缩；⑤将浓缩后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm离心，取上清溶液保存备用；c.支架构建和交联将软骨细胞外基质冻干海绵溶于纯水后与丝素蛋白溶液混匀为浆料，注入模具，采用定向结晶技术在‑15～‑80℃下结晶12～24h，真空冷冻干燥12～24h；取出后，进行紫外线照射物理交联和化学试剂交联，烘干，灭菌。