[发明专利]一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法

摘要

本发明提供了一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，通过培育无菌苗、测定长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮源的影响、短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响、样品处理、结果计算等过程，深入分析酸度对植物吸收铵态氮、硝态氮、氨基酸的影响。本发明方法设计合理，采用完全无菌的培养环境，可以深入分析氨基酸对植物的营养贡献，采用同位素标记技术，可以有效准确的区分酸度对植物吸收不同氮源的影响，实现了准确且深入的研究环境因子尤其是酸度对植物吸收特定氮源的影响。本发明方法为研究未来环境变化对植物生长尤其是氮素吸收的影响提供了方法基础。

主权项

一种测定酸度影响植物选择性吸收氮源的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）无菌苗的培育：选取饱满的植物种子，在常温下浸泡12h，之后依次采用70%酒精浸泡1分钟、无菌水冲洗3次、10%过氧化氢浸泡5分钟、无菌水冲洗3次、0.1mol L^‑1氯化汞浸泡5分钟、无菌水冲洗5次的灭菌方法，之后再将灭菌后的种子放置于培养皿中发芽3‑5天，待植物根系生长至约1cm，将一粒种子放置于已灭菌的装满0.5%琼脂的50ml离心管中，置于无菌培养台上培养1‑3天，植物通过离心管盖子中心的直径为0.3cm的小孔长出，采用南大704硅橡胶密封小孔，待硅胶定型后，添加营养液；（2）长期酸度对植物选择性吸收氮源的影响：供试氮源为NO₃^‑、NH₄⁺、甘氨酸，三种，等氮量混合，总浓度为3mM，且每次只标记其中一种氮源，标记物丰度值为50.22 at.% ¹⁵NO₃^‑、50.17 at.% ¹⁵NH₄⁺、50.16 at.% ¹⁵N‑甘氨酸，酸度为pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0五个梯度，共15个处理，采用添加1mol L^‑1H₂SO₄或者 NaOH调节酸度，每种酸度处理设置一空白，以检测自然丰度，每三天更换一次营养液，培养25天后，测定植物地上部及根系的生物量及¹⁵N丰度；（3）短期测定酸度对植物吸收氮源的影响：以3mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，采用步骤（1）方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗，采用无菌水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中“饥饿”培养一整夜，将植物放置于含3mM 98.10 at.% ¹⁵N‑甘氨酸的溶液中，用pH=4.2、6.2、8.2三个酸度处理，吸收4h后破坏性采样；（4）短期特定酸度对植物吸收氮源方式的影响：以3mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，采用步骤（1）方法无菌培养植物25天，取长势基本一致的植物幼苗，采用无菌水将离心管及植物根系多次冲洗，放置在无菌水中“饥饿”培养一整夜，选取6株长势一致的植物幼苗，将其根系预先放置于50 μmol L^‑1 CCCP溶液中1小时，使其根系失活，然后以不用CCCP溶液处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98.10 at.% ¹⁵N‑甘氨酸的溶液中，用pH=4.2、6.2、8.2三个酸度处理，进行标记氮源的短期吸收方式试验，吸收4h后破坏性采样；（5）样品处理：经过步骤（2）的长期吸收和步骤（3）、（4）的短期吸收的植物样品采收后，将地上部和地下部分开，植物根系先用超声波清洗，然后用0.5 mol L^‑1 CaCl₂清除吸附在根系表面的氮素，最后用无菌水冲洗干净，并用吸水纸吸干，植物根系和地上部样品用冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01 mol L^‑1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的¹⁵N丰度值；（6）测定氮源：根据植物对某一氮源的吸收是根据植物体内的¹⁵N含量来确定，采用以下公式计算：N_uptake指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量，A_s 是植物根系或者地上部的¹⁵N丰度值，A_c 指的是未添加标记氮源的¹⁵N空白丰度值，A_f是混合氮源中某一标记氮源的丰度值，在长期酸度对植物吸收氮源的影响中，为50.16%甘氨酸、50.22% NO₃^‑、50.17% NH₄⁺，在短期吸收中，为98.10% 甘氨酸，指的是植物地上部或根系的总氮量。