[发明专利]基于测序基因分型技术的猪SNP标记位点的分析方法

摘要

本发明提供了一种基于测序基因分型技术的猪SNP标记位点的分析方法，包括以下步骤：(1)预测用EcoRI与MspI的双酶切猪基因组所获得的酶切片段分布情况；(2)根据EcoRI与MspI的酶切识别序列设计通用接头、条形码接头及PCR扩增引物；(3)构建简化基因组测序文库；(4)利用步骤(3)构建的文库进行上机测序；(5)根据测序结果获得SNP标记位点。本发明提供的方法中所使用的酶切组合适用于所有的猪品种，利用该组合进行简化基因组测序，能够得到高于目前市场已有芯片上的SNP数目，能够用于全基因关联分析研究和基因组选择研究，同时还能保证单个个体的分型成本低于目前流行的芯片。

主权项

1.一种基于测序基因分型技术的猪SNP标记位点的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)预测用EcoRI与MspI的双酶切猪基因组所获得的酶切片段分布情况；(2)根据EcoRI与MspI的酶切片段分布特点设计通用接头、条形码接头及PCR扩增引物；(3)构建简化基因组测序文库；(4)利用步骤(3)构建的文库进行上机测序；(5)根据测序结果获得SNP标记位点；步骤(2)中所述的通用接头带有与限制性内切酶MspI相同的粘性末端序列，所述的条形码接头带有与限制性内切酶EcoRI相同的粘性末端序列；所述通用接头是由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列退火形成的双链DNA，其中SEQ ID NO：1经过5’磷酸化修饰；所述条形码接头是由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列退火形成的双链DNA；其中SEQ ID NO：4经过5’磷酸化修饰，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的n和m表示长度为5‑9bp的任意短核苷酸条形码序列；步骤(2)所述的PCR扩增引物如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；步骤(3)中包括以下步骤：(a)利用限制性内切酶组合EcoRI‑MspI对猪基因组进行酶切；(b)制备通用接头和条形码接头；(c)将通用接头和条形码接头按一定比例混合以形成接头混合物，然后将其与酶切产物进行连接反应，获得连接产物；(d)将连接产物等比例进行混池，获得混池后的连接产物；(e)在混池后的连接产物中加入1.2‑1.4倍体积的磁珠进行第一纯化获得第一纯化产物；(f)在所述第一纯化产物中加入0.8‑0.9倍体积的磁珠进行第二纯化获得第二纯化产物；(g)对第二纯化产物进行PCR扩增获得PCR产物；(h)在PCR产物中加入1.2‑1.4倍体积的磁珠进行第三纯化获得第三纯化产物；(i)在第三纯化产物中加入0.8‑0.9倍体积的磁珠进行第四纯化获得简化基因组测序文库；所述第一纯化和第三纯化的步骤相同，具体包括：加入磁珠后，在旋转仪上室温孵育18‑22min获得孵育后体系；孵育结束后在孵育后体系中加入0.9‑1.1倍体积的70％乙醇，静置30‑40s后缓慢旋转，使磁珠在罐壁上移动，待溶液澄清后，去除上清液，再重复此步骤一次获得沉淀；其中，相对于100μL所述孵育后体系，每次添加的70％乙醇的量为90‑110μL；再在所获得的沉淀中加入Low TE，用移液器上下吸打后，振荡10s，离心后静置澄清获得上清液；其中，相对于100μL所述沉淀，Low TE的添加量为140‑160μL；第二纯化和第四纯化的步骤相同，具体包括：加入磁珠后，在旋转仪上室温孵育13‑16min；孵育结束后加入0.9‑1.1倍体积的70％乙醇，静置30‑40s后缓慢旋转，使磁珠在罐壁上移动，待溶液澄清后，去除上清液，重复此步骤一次获得沉淀；再在所获得的沉淀中加入Low TE，用移液器上下吸打后，振荡10s，离心后静置澄清获得上清液；其中，相对于100μL所述沉淀，Low TE的添加量为30‑50μL；步骤(b)中所述的通用接头的退火体系为：100μM SEQ ID NO:1 5μL；100μM SEQ ID NO:2 5μL，5×Annealing Buffer 10μL，无核酸酶水30μL；退火程序为：加热至95℃，并以1℃/min的速度降温至25℃，25℃保温30min后于4℃保存；条形码接头的退火体系为：100μM SEQ ID NO:3 5μL；100μM SEQ ID NO:4 5μL，5×Annealing Buffer 10μL，无核酸酶水30μL；反应程序为：95℃3min，以1℃/min的速度降温，直至降到25℃，25℃保温30min后于4℃保存；步骤(c)中所述的连接反应的体系为：酶切产物20μL，5×DNA Ligase Reaction Buffer 8μL，DNA连接酶2μL，无核酸酶水5μL，接头混合物5μL；混匀后置于PCR上，反应程序为：22℃保温1h,65℃保温30min，降温至4℃保存。