[发明专利]一种高效表达猪CYP1A1基因的真核表达载体构建方法

摘要

本发明涉及一种高效表达猪CYP1A1基因的真核表达载体构建方法，属于分子生物学领域。针对猪细胞色素P450 家族CYP1A1 基因的克隆及真核表达载体构建，设计含特定酶切位点和保护碱基的特异引物，应用PrimerSTAR高保真酶克隆获取特异编码序列，构建CYP1A1 基因重组质粒，特异酶切处理并与线性化载体连接获得高效表达猪CYP1A1 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/zeo-CYP1A1。该表达载体用于细胞代谢及特异疾病免疫反应研究，CYP1A1 基因在高效增强子SV40及高效启动子T7PCMV的驱动下高效超量表达，激活下游基因及相应调控通路，影响细胞生理机能。

主权项

一种高效表达猪CYP1A1基因的真核表达载体构建方法，其特征在于以下步骤：1)猪CYP1A1基因的克隆以猪肝组织样为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以GenBank中猪CYP1A1基因cDNA序列NCBI Reference Sequence:NM_214412.1为模板设计引物设计包含特异酶切位点和保护碱基的特异引物，应用Primer STARMax高保真酶对猪CYP1A1基因编码序列进行PCR扩增；扩增片段包含猪CYP1A1基因cDNA序列1551bp，酶切位点及保护碱基21bp，片段总长1572bp，猪CYP1A1基因cDNA序列见SEQ ID NO.1；2)真核表达载体pcDNA3.1(+)/zeo‑CYP1A1的构建将CYP1A1基因连接到PMD18‑T载体中，转化至DH5α大肠杆菌，提取菌株中pMD‑18‑T‑CYP1A1重组质粒，XhoI、NotI双酶切鉴定后回收CYP1A1基因片段，同时用XhoI、NotI双酶切处理pcDNA3.1/zeo(+)载体质粒，利用T4连接酶与回收的CYP1A1基因片段进行连接后，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，一种高效表达猪CYP1A1基因的真核表达载体pcDNA3.1/zeo(+)‑CYP1A1构建成功。