[发明专利]一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，适用于外周血、脐血来源的NK/CIK和DC‑NK/CIK细胞培养；包括血液采集及单个核细胞分离、采用悬浮的细胞培养NK/CIK细胞、采用贴壁的单核细胞培养DC细胞、将NK/CIK细胞和DC细胞和按照10：1按比例进行混合培养；本发明采用未经分选的单个核细胞进行培养，利用高效的细胞因子组合，培养14天后，在体系中产生NK/CIK混合效应细胞，细胞纯度近90％，其中52.4％的NK细胞和33.3％的CIK细胞，表达杀伤标志的细胞占80％以上，所有的NK细胞高表达活化标志CD161；诱导的DC‑NK/CIK细胞具有显著的增殖能力和靶向杀伤肿瘤的能力，尤其针对NK细胞不敏感的肿瘤细胞，其杀伤能力显著提高，扩大了NK细胞临床治疗肿瘤的范围。

主权项

1.一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：一、血液采集及单个核细胞分离(1)、采集外周血或者脐血50～80mL，收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，迅速摇匀，避免发生凝血；(2)、将采血袋和生物冰袋一起放入保温箱，保持温度为4～8℃；12小时内运送至实验室；(3)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，使稀释的血液与淋巴细胞液的体积比为3:2，注意保持液层分界清晰；(4)、将离心管在900g、20℃的条件下离心25min，离心完毕后，可观察到离心管中液面分层，将单个核细胞层的液体，移入新的离心管中；(5)、用2倍于单个核细胞层的液体体积的生理盐水稀释单个核细胞层液体，在400g、4℃下离心5min进行洗涤；洗涤两次后去除上清；(6)、用无血清培养液重悬单个核细胞，调节细胞密度为3×106/mL，于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育1小时，分别收集悬浮细胞和贴壁的单核细胞；二、DC细胞培养(1)、用DC细胞完全培养液重悬步骤一的(6)中得到的贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM‑CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL‑4，于37℃、5％体积分数的CO2培养箱中培养；(2)、培养第3天，半量补充新鲜的DC细胞完全培养液培养液和细胞因子GM‑CSF和IL‑4，并向每mL的细胞培养液中加入100～200μg的肿瘤细胞裂解液，于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中继续孵育16～24小时；(3)、加入促熟细胞因子组合，于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中继续孵育16～24小时；(4)、收集成熟DC细胞；所述步骤二的(3)中所述的促熟细胞因子组合为每mL的细胞培养液中加入10～20μg的poly(IC)、5～10μg的LPS、500～1000IU的IFN‑γ和10～20ng的TNF‑α；所述步骤二的(1)中的DC细胞完全培养为含1％质量分数的人血白蛋白的X‑VIVO无血清培养液；三、NK/CIK细胞培养(1)、收集步骤一的(6)中得到悬浮细胞，离心后，用NK/CIK细胞完全培养液重悬细胞，调节细胞密度为3～5×106/mL，向每mL的细胞中添加细胞因子200‑500U的IL‑2、50‑100ng的OKT3和20‑50μg的PHA，于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中培养3～5天，收集细胞，1500rpm下离心，去除上清，生理盐水洗涤一次；(2)、 用新鲜的完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×106/mL，向每mL的细胞中添加200‑500U的细胞因子IL‑2和5‑20ng的IL‑15继续培养；(3)、在培养第5天，将得到的NK/CIK细胞和步骤二的(4)中得到DC细胞和按照10：1比例进行混合培养；每2‑3天添加新鲜培养基，向每mL的细胞液中添加细胞因子200～500U的IL‑2和5～20ng的IL‑15，维持细胞密度为1～2×106/mL；(4)、培养第14天，收集细胞，流式细胞仪检测表型以及进行细胞计数，计算增殖能力；所述步骤三(1)中的NK/CIK细胞完全培养液为含1～5％质量分数的人AB血清的X‑VIVO无血清培养基。