[发明专利]猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法

摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，首先筛选出PCV₂增殖敏感的细胞，扩大培养后消化细胞，接种到一级生物反应器，MEM细胞生长液培养后排出生长液，补加MEM细胞维持液，培养后排出维持液，细胞消化、分散后转入二级生物反应器中培养，收获细胞生长液和细胞维持液，细胞消化、分散后再转入三级生物反应器中培养，收获细胞生长液和细胞维持液，继续在三级生物反应器中用细胞生长液和细胞维持液交替培养，收获细胞生长液和细胞维持液至12代。PCV₂增殖敏感的细胞适宜微载体连续多代次收获抗原培养；生物反应器生产效率高、成本低；本发明的维持液抗原效价较传统转瓶的抗原效价提高10-20倍。

主权项

一种猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)准备PK15克隆细胞用PK‑15细胞克隆得到PK15克隆细胞备用，该PK15克隆细胞的分类命名为猪肾上皮细胞PK15，该细胞在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO:11198；(2)PCV₂增殖敏感细胞筛选消化不同的PK‑15克隆细胞和母细胞并同步接种相同剂量的PCV₂病毒，待细胞长满至少50％时更换细胞维持液为MEM细胞维持液，37℃培养2d，用间接免疫荧光试验检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV₂增殖敏感的细胞，然后置37℃恒温箱连传3代进行种细胞扩繁，细胞长满后加入适量细胞冻存液，于液氮冻存；(3)PCV₂增殖敏感细胞增殖将冻存的PCV₂增殖敏感细胞在T25细胞瓶中进行复苏，待细胞长满单层后，以胰酶‑EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM细胞生长液传代培养，按1:4至1:6传代比例逐级传代放大至15L转瓶内培养，按1:4至1:5传代比例在15L转瓶中扩传；(4)PCV₂悬浮培养及带毒传代消化所述15L转瓶中生长良好的PCV₂增殖敏感细胞，按终浓度6‑8×10⁵cells/ml的接种密度接种预处理好的含微载体的16L一级生物反应器，培养体积不小于8L，以含5‑10％新生牛血清的MEM细胞生长液培养细胞，在接种细胞时按0.2％终体积同步接种PCV₂种毒，细胞与种毒接种后，一级生物反应器中培养的带毒细胞标记为F1代；待细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，排出F1代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，排出F1代细胞维持液；以胰酶‑EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的二级生物反应器培养；二级生物反应器的体积至少为一级生物反应器的2倍，培养体积不小于二级生物反应器体积的1/2，二级生物反应器中的带毒细胞标记为F2代；待二级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F2代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F2代细胞维持液；以胰酶‑EDTA消化微载体上的细胞，以含8％新生牛血清MEM细胞生长液终止消化并分散细胞，将细胞转至预处理好的含微载体的三级生物反应器培养；三级生物反应器为的体积至少为二级生物反应器的2倍，培养体积不小于三级生物反应器体积的1/2，三级生物反应器中的带毒细胞标记为F3代；待三级生物反应器中细胞长满至少80％时停止搅拌，沉淀承载细胞的微载体，收获F3代细胞生长液，补加预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F3代细胞维持液；(5)带毒细胞悬浮培养与连续收毒(5.1)带毒细胞生长液培养三级生物反应器中培养的带毒细胞，收获F3代细胞维持液后，加入预热至室温的含5‑10％新生牛血清的MEM细胞生长液，带毒细胞标记为F4代；生长液培养24h后，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞生长液；(5.2)带毒细胞维持液培养三级生物反应器中的带毒细胞，收获F4代细胞生长液后，加入预热至室温的MEM细胞维持液，培养48h，沉淀微载体与细胞，收获F4代细胞维持液；(5.3)带毒细胞连续收毒收获F4代细胞维持液后，重复步骤(5.1)的操作，以生长液培养带毒细胞24h后，收获F5代细胞生长液；重复步骤(5.2)的操作，以维持液培养带毒细胞48h后，收获F5代细胞维持液；重复上述步骤，连续收毒至F12代以上，每个代次取样观察细胞状态；(6)PCV₂抗原液检测对收获不同代次的生长液与维持液分别进行无菌检验与PCV₂病毒含量测定。