[发明专利]一种苜蓿褐斑病的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，包括如下步骤：病原体分离后置于PDA培养基平台上培养，用无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50μm/mL苯骈咪唑的0.3％水琼脂培养基上培养4天；选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100％，温度20℃，无光照的条件下，接种20h；接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000lux和黑暗每12h交替一次，每天观察记录侵染及病害发展情况。本发明通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。

主权项

一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mm×3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7‑1.1％的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4‑6s，用含有0.025％的升汞和0.15～0.25％吐温混合液浸泡2～5min，用无菌水清洗5～8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；S2、将所得的组织块置于培养基上，于20‑30℃恒温培养箱中进行培养，36‑72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7‑10d后，用40～60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50μm/mL苯骈咪唑的0.3％水琼脂培养基上培养4天；S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100％，温度20℃，无光照的条件下，接种20h；S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000lux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22℃，无光时培养温度为18℃，每天观察记录侵染及病害发展情况。