[发明专利]一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法

摘要

本发明公开了一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下：血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800-2200g离心力下离心4-6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92-97℃下搅拌6-10min，再在15000-17000g离心力下离心8-12min，取上清液为模板做PCR；配置定量PCR反应体系；定量PCR反应。本发明通过对血浆或血清进行处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了DNA提取步骤和实验误差，采用新的荧光染料SuperGreen，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高，可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA，试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用，操作简便。

主权项

一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800‑2200g离心力下离心4‑6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92‑97℃下搅拌6‑10min，再在15000‑17000g离心力下离心8‑12min，取上清液为模板做PCR；(2)配置定量PCR反应体系：快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为0.35‑0.45mM；(3)定量PCR反应：用于ROCHE、ABI定量PCR设备，在92‑98℃下反应4‑6min；92‑98℃下反应4‑6s，55‑65℃下反应18‑22s，70‑74℃下反应18‑22s，重复45个循环。