[发明专利]一种南非半边莲遗传转化方法

摘要

一种南非半边莲遗传转化方法，包括以下步骤，(1)外植体的制备；(2)质粒载体构建；(3)通过电击将双元质粒载体导入农杆菌的方法；(4)半边莲的遗传转化。本发明转化效率高、方法完整，可用作南非半边莲遗传转化的标准方法。本发明对南非半边莲的转基因育种有重要意义，也为南非半边莲用于基因功能验证提供技术支撑。

主权项

一种南非半边莲遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的制备：首先培养无菌苗，获取幼苗真叶作外植体；(2)质粒载体构建：质粒载体pIG121Hm通过大肠杆菌进行扩增，提取、纯化质粒DNA后用DNA限制性内切酶酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法进行纯化，备用；通过PCR对目标基因进行扩增，设计的引物含有相应的位点，用T4连接酶将制备的目标基因DNA与空载体进行定向连接。(3)农杆菌电击转化：将质粒载体通过电击导入浓度为OD₆₀₀＝0.6～1.0感受态农杆菌细胞EHA105中，加入LB培养基，室温静置50～70min，将菌液涂布到含50mg/L卡那霉素和潮霉素的LB平板上，在28℃下培养2～3d，通过PCR方法筛选阳性克隆，接着放大和保存阳性EHA105细胞，然后挑取成功转化双元质粒载体的农杆菌EHA105，接种于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB液体培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h；接着挑取过夜培养物于含50mg/l卡那霉素和潮霉素的YEB培养基中，摇床25～28℃，转速150～200spm，培养18～24h，获得菌液浓度为OD600＝0.6～1.0；挑取细胞于YEB培养基中，培养6～12h，将菌液在3000～6000rpm条件下离心5～15min，用细菌悬浮液培养基重新悬浮农杆菌，使得菌液浓度为OD600＝0.2用于转化；(4)半边莲的遗传转化：将真叶剪成5mm×5mm叶片，浸泡在EHA105农杆菌悬浮液中培养3～5min，将浸泡后的叶片外植体转移到共培养培养基上，在24～26℃下黑暗培养2.5～3.5d，用清洗培养基清洗叶片2～4次；接着将叶片外植体转接到去农杆菌介导培养基上，在24～26℃，光照条件下培养1周；接着将叶丝转移到筛选培养基(SM)，24～26℃下光照培养，每2周继一次代，持续1个月；接着在选择/再生培养基上培养愈伤组织，24～26℃光照培养1个月；然后转接幼苗到生根培养基上，在24～26℃光照培养16h，培养6～8天，直到长出完整的转化植株时炼苗移植。