[发明专利]用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是将海洋致病菌抗体固载到氨基化磁珠表面得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液的步骤；海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合的多功能化氧化石墨烯的合成步骤；电极预处理以及将免疫磁珠固载磁性玻碳电极表面的步骤；最后将待测海洋致病菌、多功能化氧化石墨烯依次吸附于磁性玻碳电极表面即可，将得到夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，即可计算得到待测样品溶液中海洋致病菌的准确浓度，优点是检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强。

主权项

一种用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)免疫磁珠的合成在干净的烧瓶中加入5～10mg的氨基化磁珠，再加入2～5mL含有3wt％戊二醛的0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，37℃孵育3h后，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL；加入50～150μL 0.5mg/mL海洋致病菌一抗溶液，37℃孵育1h，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL；加入2wt％的牛血清白蛋白溶液50～150μL以封闭非特异性活性位点，37℃孵育1h，外加磁铁磁性分离后用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3～5次，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至2～5mL，即可得到表面覆盖有海洋致病菌抗体的免疫磁珠溶液，4℃下储存备用；(2)多功能化氧化石墨烯的合成在干净的试管中加入150～250μL的1mg/mL氧化石墨烯，超声1h，然后加入100～300μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1mol/L稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h后，8000r离心15min，去除上清液后，0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL；加入40～60μL 10^‑5～0.001mol/L电化学发光体溶液和40～60μL 0.01～0.1mg/mL海洋致病菌二抗溶液，混合均匀，同时滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液至溶液pH＝8～10，常温振荡孵育4h，8000r离心15min，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL；再加入2wt％的牛血清白蛋白溶液80～120μL以封闭非特异性活性位点，常温振荡孵育1h，8000r离心15min，去除上清液后，用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至0.5～1mL，即可得到海洋致病菌抗体和电化学发光体同时化学键合的多功能化氧化石墨烯溶液，4℃下储存备用；(3)电极修饰将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝浆液抛光处理，用乙醇、水依次超声2min，洗净，氮气吹干；取5～10μL步骤(1)得到的免疫磁珠溶液，滴涂于处理过的磁性玻碳电极中心，免疫磁珠即被均匀地牢固吸附在电极表面；用水洗净后即得固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极；(4)夹心式电化学发光免疫传感器的组装将步骤(3)所得的固载有免疫磁珠的磁性玻碳电极浸泡在含有待测海洋致病菌的溶液中，37℃下孵育1h；清洗后，再滴涂5～10μL步骤(2)得到的多功能化氧化石墨烯溶液中，37℃下孵育1h；清洗后，即组装成用于检测海洋致病菌的夹心式电化学发光免疫传感器。