[发明专利]一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法

摘要

本发明公开了一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，该方法将一个已知序列样本和一个混合样本的基因组DNA分别进行PCR，并将获得的单链PCR产物按照特定的两核苷酸加入方法进行焦测序，每个样本得到两组两核苷酸合成焦测序信息、并进行校正；将两组校正后的混合样本测序信息和已知序列样本分别进行比较，如果混合样本的测序信息和已知序列样本的测序信息两组信息均无变化，则表明混合样本与已知序列样本测序信息一致，无新突变/SNP位点；如果混合样本的测序信息和已知序列样本的测序信息两组信息中至少存在一组信息不同，则表明混合样本与已知序列样本测序信息不完全一致，表明有新突变/SNP位点存在。

主权项

1.一种用于非诊断目的的基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)分别提取标准样本的DNA和混合样本的DNA；(2)分别以标准样本的DNA和混合样本的DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)对步骤(2)得到的PCR产物进行测序，每个样本至少进行两组包含四个核苷酸的两核苷酸合成焦测序，两核苷酸的形式合包括：(dATPαS+dGTP)、(dATPαS+dCTP)、(dATPαS+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)，得到混和样本和标准样本的测序信息；(4)对混和样本和标准样本的测序信息进行校正，再进行关联分析；步骤(4)中，对步骤(3)得到标准样本和混合样本的至少两组两核苷酸合成焦测序信息进行校正，所述的校正是对标准样本和分析样本的焦测序信息进行除法或减法运算；步骤(4)中，所述关联分析为：将两核苷酸加入相同测序条件的标准样本和混合样本的焦测序信息进行比较，得到至少两组标准样本和混合样本的比较数值，所述比较是指依次对标准样本和分析样本的焦测序信息进行除法或减法运算；如果标准样本和分析样本的焦测序信息比较的结果完全一致，即在误差范围内除法运算中相应峰高的比值均为1，或减法运算中相应峰高的值均为0，则表明混合样本与已知序列样本测序信息一致，无新突变/SNP位点；如果标准样本和分析样本的焦测序信息中至少存在一组信息不同，即在误差范围内除法运算中相应峰高的比值至少有一个不等于1，或减法运算中相应峰高的值至少有一个不等于0，则表明有新突变/SNP位点存在，根据两个样本的不同测序信息，推出具体的突变/SNP信息，其中，所述的基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法如下：(3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05～0.2M NaOH溶液中变性；将未固定的另一条DNA链清除；得到固定的单链DNA模板；(3-2)测序引物杂交：将测序引物与固定的单链DNA模板在杂交反应体系中，70～80℃下放置5～10min，自然冷却至室温，得到杂交产物；(3-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤(3-2)得到的杂交产物混合，焦测序反应按照两核苷酸顺序加入方式合成进行；步骤(3-2)中，所述测序引物是与固定在磁珠上的单链DNA模板完全互补未标记PCR引物序列中3’末端至少缺失一个碱基的序列，保障混合样本第一个测序信息来自确定碱基；步骤(3)中，两核苷酸参与的每个测序反应获得的测序信息包括两个核苷酸的类型、测序信号强度，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度用峰高表示或者用转化的核苷酸合成的数目表示，测序信号强度的数值为正整数和零或者正非整数；所描述的标准样本包括序列已知的DNA单模板样本，或者序列和组成已知的DNA多模板样本；所描述的两核苷酸合成焦测序信息的校正，通过测序引物合成标准样本和混合样本中共有的已知序列，即与未修饰PCR引物序列中3’末端的一个或者若干个碱基完全互补，而获得至少一个测序信息为基准峰，以之调整因标准样本和混合样本总DNA模板量不一致产生的信号强度不一致；步骤(2)中，所述PCR扩增用的一条引物的5’端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰。