[发明专利]利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法

摘要

本发明公开了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法。先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的载体pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，蚕蛾自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，育成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。

主权项

1.一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法，其特征在于该方法的步骤如下：(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；所述的质粒pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed‑SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即Fibroin H chain Promoter‑Fibroin H chain signal peptide‑(2‑16)xMaSp1‑Fibroin H chain PolyA；所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因序列长度是包含2倍到16倍的MaSp1基因重复单元Type1‑Type2‑Type3‑Type4；MaSp1基因重复单元Type1‑Type2‑Type3‑Type4基因序列如SEQ ID NO.1；(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；(6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕；(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。