[发明专利]快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法

摘要

本发明涉及快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法，其引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，利用该引物对在上、下游引物分别加入不同的核酸分子标记物，标记引物的PCR产物能够直接用免疫金试纸条判定，简化了操作步骤，方便，并且特异性好，灵敏度高，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加10倍，是一种理想的家蚕成品卵中家蚕微孢子虫的检测手段，具有很好的应用前景。

主权项

1.利用快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒在非疾病诊断中检测家蚕成品卵中家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，所述试剂盒包括引物对和胶体金免疫层析试纸条；所述引物对由生物素标记SEQ ID NO.7和羧基荧光素标记的SEQ ID NO.8组成，所述胶体金免疫层析试纸条的点样区喷涂有连接其中一种核酸分子标记物抗体的胶体金颗粒，检测线固定有与另一种核酸分子标记物特异结合的配体；所述胶体金免疫层析试纸条由以下方法制备：先用抗羧基荧光素兔抗与胶体金颗粒交联，形成胶体金-抗羧基荧光素兔抗复合物，然后喷涂于点样区；再用生物素的配体链霉亲和素在纤维膜上按线状喷涂，形成检测线，并在检测线下游固定质控线，质控线上包被羊抗兔IgG抗体；最后与吸水滤纸、样品垫和底板组装胶体金免疫层析试纸条；/n所述试剂盒还包括待检样品处理液、裂解液和展开液，所述待检样品处理液为质量分数为4%的KOH；所述裂解液含体积分数为1%的乙基苯基聚乙二醇和体积分数为2%的TritonX-100；利用待检样品处理液和裂解液提取DNA的步骤如下：取蚕卵加水研磨后离心，收集沉淀，在沉淀中加入待检样品处理液，混匀18~25℃放置10min后用水清洗，离心收集沉淀，然后向沉淀中加入裂解液，100℃放置1h；/n所述展开液各组分浓度如下：Tris 10mM，BSA 1%，NaCl 137mM，KCl 2.7mM， Na₂HPO₄ 10mM和KH₂PO₄ 2mM；/n具体步骤如下：/nA、提取待测样品DNA，然后以核酸分子标记物分别标记SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物对进行PCR扩增，收集扩增产物；/nB、将步骤A）所得扩增产物点于所述胶体金免疫层析试纸条的点样区，并用含核酸变性剂的展开液层析，根据检测线是否有可见条带，判定阴性或阳性；如果有可见条带，判定为阳性，如果无可见条带，判定为阴性。/n