[发明专利]一种重组人成纤维细胞生长因子(FGF)-18的生产方法

摘要

本发明公开了一种表达和生产rhFGF‑18的方法。通过生物信息学手段优化设计合成FGF‑18核苷酸序列全长，筛选pET系列载体与大肠杆菌宿主细胞，获得可溶性表达且稳定遗传的工程菌株，并建立了高密度发酵方法和二步柱层析纯化方法及建立相应活性检测方法，使大规模生产rhFGF‑18成为可能。在此基础上，进一步探讨rhFGF‑18在皮肤烧烫伤、难愈性溃疡治疗或黏膜损伤的组织修复、生物美容及在雄激素性脱发、脂溢性脱发、斑秃及放化疗后的脱发修复治疗领域的应用。

主权项

1.一种用于制备有体内生物学活性的重组人成纤维细胞生长因子‑18的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：设计合成rhFGF‑18的全长序列如SEQ ID NO.1所示，将rhFGF‑18全长序列用BamH I和Nde I酶切后插入表达载体pET3a并转入宿主细胞Origima(DE3)，构建了高效稳定表达的pET3a‑rhFGF‑18/Origima(DE3)工程菌株；①在适当营养条件下高密度可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子‑18，具体步骤包括：将工程菌株接种于罐内培养基中进行发酵，所述罐内培养基的具体成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，磷酸氢二钾3 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，氯化铵4 g/L，硫酸镁1 g/L，氯化钙0.02 g/L，维生素B1 0.01g/L，葡萄糖5 g/L以及适量微量元素；在发酵过程中通过流加补充碳源、氮源、无机盐调节溶解氧与pH值的变化；培养温度为37℃；诱导温度为33℃；培养pH值为6.8～7.0；诱导pH值为7.1～7.2；诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L；诱导时机为OD600为18～20；诱导时间为4h～5h；培养和诱导时的溶解氧均≥25％；②分离纯化重组人成纤维细胞生长因子‑18蛋白，具体步骤包括：采用成分为50mM Tris，2mM EDTA‑2Na，0.1M NaCl，1％Triton X‑100，5mM DTT和适量蛋白酶抑制剂，pH7.5的细胞裂解缓冲液进行菌体破碎，离心收集上清后进行超滤，然后采用层析介质SP Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow进行阳离子交换层析，最后采用层析介质Heparin Sepharose 6FF或HiTrap Heparin HP进行肝素亲和层析。