[发明专利]一种利于细胞粘附的功能丝素膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种利于细胞粘附的功能丝素膜的制备方法，步骤为：将携带有(-RGD-)₄多肽或(-RGD-)₈多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌细胞，诱导培养数小时；离心细胞菌液，收集并破碎菌细胞，将破碎后的蛋白上清液纯化、酶切一步法收集、冻干，获得(-RGD-)₄多肽粉末或(-RGD-)₈多肽粉末；将家蚕蚕丝或蚕茧进行脱胶、溶解、透析、过滤浓缩后，浇注于一定面积的器皿中风干，得到家蚕丝素膜；将家蚕丝素膜浸渍于过量的交联剂溶液中，再加入(-RGD-)₄多肽或(-RGD-)₈多肽，4℃过夜反应，即得功能丝素膜。本发明制备出的功能丝素膜具有优异的细胞粘附性能，属于生物医用材料，没有细胞毒性，具有细胞粘附蛋白的识别位点，有利于细胞粘附、生长、促进缺损组织愈合。

主权项

一种利于细胞粘附的功能丝素膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)根据对柞蚕丝素或天蚕丝素氨基酸序列的分析，设计一个其中含有RGD三肽序列的单元肽段GSGAGGRGDGGYGDGSS，命名为(‑RGD‑)₁多肽基因；步骤2)采用基因工程技术对所述(‑RGD‑)₁多肽基因进行4倍克隆，并设计构建携带有(‑RGD‑)₄多肽基因的原核系统表达载体，所述(‑RGD‑)₄多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1；或，采用基因工程技术对所述(‑RGD‑)₁多肽基因进行8倍克隆，并设计构建携带有(‑RGD‑)₈多肽基因的原核系统表达载体，所述(‑RGD‑)₈多肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2；步骤3)将已经设计构建好的携带有(‑RGD‑)₄多肽基因或(‑RGD‑)₈多肽基因的原核系统表达载体转染大肠杆菌细胞，用Luria‑Bertani培养基经异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导培养数小时；步骤4)离心细胞菌液，收集菌细胞并破碎菌细胞，然后将破碎后的蛋白上清液加入到谷胱甘肽转移酶的亲和层析中一步法纯化、酶切、收集、冻干，最终获得(‑RGD‑)₄多肽粉末或(‑RGD‑)₈多肽粉末，使用时配置一定浓度的水溶液；步骤5)将家蚕蚕丝或蚕茧进行脱胶、溶解后，灌注于透析袋内，用去离子水透析，然后过滤浓缩至3～8％的家蚕丝素蛋白溶液，浇注于一定面积的器皿中风干，得到家蚕丝素膜；步骤6)将制得的上述家蚕丝素膜浸渍于过量的交联剂溶液中，再加入(‑RGD‑)₄多肽或(‑RGD‑)₈多肽，4℃过夜反应，即得功能丝素膜。